โพสต์แนะนำ

สัญลักษณ์ไฟโชว์ที่หน้าปัดรถยนต์

สัญลักษณ์นี้เป็นสัญลักษณ์พื้นฐานของรถยนต์ทุกค่ายที่พึงมี รูปร่างอาจต่างกันนิดหน่อยครับ

วันพฤหัสบดีที่ 1 มกราคม พ.ศ. 2558

Khwan01_Anaerobe (บัคเตรีจำพวกที่ไม่ต้องการออากาศหายใจ)

ไฟล์ An exploratory study into the putative prebiotic activity of fructa ..
ต้นฉบับ Google Drive
♥ เรื่อง Anaerobe (บัคเตรีจำพวกที่ไม่ต้องการออากาศหายใจ)

Linear inulin-type fructan (ITF) prebiotics have a putative role in the prevention of colorectal cancer, whereas relatively little is known about branched fructans.
This study aims to investigate the fermentation properties and potential prebiotic activity of branched fructans derived from Agave angustifolia Haw, using the Simulator of Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME) model.
The proximal,transverse and distal vessels were used to investigate fructan fermentation throughout the colon and to assess the alterations of the microbial composition and fermentation metabolites (short chain fatty acids and ammonia).
The influence on bioactivity of the fermentation supernatant was assessed by MTT, Comet and transepithelial electrical resistance (TER), respectively.
Addition of Agave fructan to the SHIME model

significantly increased (P < 0.05), bifidobacteria populations (proximal and transverse), SCFA concen-trations (proximal, transverse and distal) and decreased ammonia concentrations in the distal vessel.

Furthermore, the fermentation supernatant significantly (P < 0.05) increased the TER of a Caco-2 cell monolayer (%) and decreased fluorescein-based paracellular flux, suggesting enhanced barrier function and reduced epithelial barrier permeability (proximal and distal vessel).
While cytotoxicity and geno-toxicity remained unaltered in response to the presence of Agave fructans.
To conclude, branched Agave

fructans show indications of prebiotic activity, particularly in relation to colon health by exerting a positive influence on gut barrier function, an important aspect of colon carcinogenesis.


1. Introduction
The colonic microbiota is continuing to gain prominence as a source of factors contributing to the aetiology and pathogenesis of a range of diseases, including colon cancer [1].
Identification of nutritional constituents that positively influence colonic health through modification of the microbiota offers a useful strategy for reducing the risk of colon cancer [2,3].
Prebiotics have emerged as food ingredients with beneficial health promoting activity through stimulation of beneficial bacteria (bifidobacteria/lactobacilli) and their associated saccharolytic metabolites (SCFA’s, particularly butyrate) [4].
Putative mechanisms responsible for prebiotic-mediated anticancer activity include improved colonic barrier function and enhanced geno-protection which have been partly attributed to the potent activity of butyrate [4,5].
Inulin-type fructans (ITF) are unquestionably the most studied prebiotic candidates to date with research demonstrating a broad range of health benefits [6]. Linear chained ITF prebiotics have consistently exhibited stimulatory effects on bifidobacterial populations alongside an increase in associated saccharolytic fermen-tation products such as short chain fatty acids in both animal and human studies [7].
The rate and extent of ITF fermentation appears to be strongly influenced by the degree of polymerisation (DP).
Fructooligosaccharides - FOS (low DP), are rapidly fermented in the proximal colon [8], whereas inulin (high DP) appears to have a more sustained fermentation profile potentially enabling it to exert protective effects in the distal regions of the colon [9,10].
Ideally, prebiotic supplementation should provide uniform stimulation of gut bacterial activities throughout the entire colon, in particular the distal colon where proteolytic fermentation predominates and is associated with the production of toxic metabolites e.g. ammonia,hydrogen sulphide, and cresol [11,12].
It has been suggested that other fructan types, in particular Agave derived fructans (AGV),which historically have been consumed by indigenous Central American populations, could potentially offer similar or enhancedbenefits to human colon health [13]. AGV have a branched fructan structure with both b(1e2) and b(2e6) linked fructosyl chains attached to the sucrose start unit, whereas ITF are limited to a linear structure with b(1e2) linkages [14].
It has been postulated that the structural branching of the Agave fructans may result in an alternative and more sustained fermentation pattern than linear ITF

leading to enhanced saccharolytic fermentation at the expense of proteolytic fermentation in the distal colon.
Furthermore, this would enable the protective effects exerted by prebiotics in the proximal colon to also be exhibited in the distal colon.
A recent study by Gomez et al. has demonstrated prebiotic activity of fructans from Agave tequiliana in batch culture studies and this current study aims to provide information on the fermentation dynamics of fructans from Agave angustifolia in the different regions of the colon [15].
In this study the prebiotic efficacy will be determined using the continuous culture Simulated Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME) model which has previously been used to characterise the fermentation profile of other prebiotic carbohydrates e inulin and FOS [10,16].
Furthermore, we will investigate the anticancer activity of the fermentation supernatant using a range of biomarkers that have been implicated as having a role in colon carcinogenesis.


2. Material and methods
2.1. Agave fructan extraction
The Agave fructans were obtained from Mercantil Orgánica S.A de C.V., a fructan distributor in Mexico.
The food grade fructan powder product was obtained from the matured stems of 7e8 year old
A. angustifolia Haw. plants.
The stems were mechanically sliced into smaller pieces, pressed to extract their juices, and finally washed with abundant hot water (60 C) to maximise recovery.
The extracted juice was then clarified, filtered, deionised, concentrated and lastly, spray dried to obtain the final product.
This commercial product has a carbohydrate composition of >96% fructans plus <4% of monosaccharides (fructose/glucose) and an average DP of 16 which was kindly donated by Dr. Iván Saldaña Oyarzábal.


2.2. SHIME culture system
The SHIME model, adapted from Molly et al. [17], is a dynamic, 5 vessel model of the human adult gastrointestinal tract with a total retention time of 76 h.
Vessels 1 and 2 are intended to model the stomach and small intestinal processes, with vessels 3, 4 and 5 modelling the proximal, transverse and distal colon respectively.
The SHIME colonic vessels were inoculated with a faecal sample of a young adult male volunteer (following written and informed consent) with no history of antibiotic treatment or colonic disor-ders 6 months prior to the study.
The study was approved by the Ethical Committee of Ghent University Hospital (Belgian registration number B670201214538).
The freshly voided faecal sample was diluted and homogenised with phosphate buffer (0.1 mol/L, pH 7), (10% w/v) and following the removal of particulate material by centrifugation (at 50,000 g for 5 min), 50 ml was introduced into each of the SHIME colonic vessels.
The microbial culture was sta-bilised over a period of 2 weeks on a carbohydrate-based medium [17] and allowed to adapt to the specific environmental conditions of the ascending, transverse and descending colon in terms of pH range, retention time and available carbon sources.
During the pretreatment control period (PRE) the SHIME was supplemented with the standard nutritional media for the first 2 weeks of the experiment.
Subsequently a three week Agave fructan (AGV) treatment period was initiated whereby the standard media (which provided 2 g/d starch) was replaced with an experimental medium in which starch was substituted with AGV (2 g/day) (Fig. 1).
The Agave experimental media was equivalent to a human intake of 4 g/day, a dose that has been shown not to exert any negative effects in human studies.
The replacement of starch with fructans in the nutritional media ensured the amount of available carbohydrates for the microorganisms remained unaltered throughout the SHIME experimental period. Following the AGV treatment period, the starch based nutritional media was re-introduced for a 2 week post-treatment control period (POST) to investigate whether them icrobial and metabolic parameters returned to PRE levels.

2.3. SHIME collection
AGV fermentation was modelled using the SHIME and samples were obtained from vessel 3 (proximal colon PV), vessel 4 (trans-verse colon TV) and vessel 5 (distal colon DV) during the PRE, AGV and POST periods.
Samples were taken and directly used for mi-crobial and metabolic analysis or stored at 80 C for subsequent testing.


2.4. Microbiota and metabolic activity analysis
2.4.1. Microbial community analysis
The quantification of bacteria groups using plate counting was adapted from Van de Wiele et al. [16], with the enumeration of colony forming units following growth on specific media (Oxoid,Hampshire, UK): lactobacilli (Rogosa agar), bifidobacteria (raffinose Bifidobacterium agar), enterococci (Enterococcus agar), enter-obacteria (MacConkey agar) and clostridia (tryptose sulfite cyclo-serin agar).


2.4.2. Short chain fatty acids
Samples from the 3 ‘colonic’ vessels were collected and frozen at 20 C for subsequent analysis. The short-chain fatty acids (SCFA) were extracted from the samples with diethyl ether (Sigma)
and determined with a Di200 gas chromatograph (GC; Shimadzu’s Hertogenbosch, The Netherlands) as described in Possemiers et al.
[18].

2.4.3. Ammonia
The protocol was adapted from Van de wiele et al. [17].
In brief, using a 1026 Kjeltec Auto Distillation unit (FOSS Benelux, Amers foort, The Netherlands), ammonium in the sample was liberated as ammonia by the addition of an alkali (MgO). The released ammonia was distilled from the sample into a boric acid solution.
The solution was backtitrated using a 665 Dosimat (Metrohm, Berchem,Belgium) and 686 Titroprocessor (Metrohm).

2.5. Fermentation supernatant preparation for colon cancer bioassays The SHIME fermentation cultures from the proximal colonvessel (PV), transverse colon vessel (TV) and distal colon vessel (DV)sampled during the PRE, AGV and POST were stored at 80 C.
Fermentation supernatants were prepared by centrifugation of the thawed fermentation slurries at 50000 g (Beckman Ultracentrifuge XL-70, Beckman Instruments, Inc., California, USA) at 4 C for 2 h.

Supernatants were filter sterilised using 0.45 mm and 0.2 mm syringe filters (Minisart, Vivascience AG, Hannover, Germany) and stored at 80 C.

2.5.1. Cell culture
The human colon cancer cell line Caco-2 (colorectal adenocar-cinoma) was obtained from the European Collection of Cell Cultures and used between passages 50e60 (Salisbury, UK).
Caco-2 cells were routinely cultured in minimum essential media (MEM), 10% foetal bovine serum, 1% penicillin streptomycin and 1% non-essential amino acids.
All tissue culture materials were purchased from Gibco (Paisley, UK).

2.5.2. Cell cytotoxicity (MTT) assay
The SHIME fermentation supernatants were assessed for cyto-toxicity in Caco-2 cells using the 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay.
This method was adapted from Gill et al. [19] and enabled toxicity of test samples to be compared to media (untreated) and positive controls (deoxy-cholic acid 250/500 mM).
Each treatment was carried out in 8 wells and the experiment repeated independently 3 times.


2.5.3. Transepithelial electrical resistance (TER) assay
The method used in this study was adapted from Gill et al. and
McGilligan et al. [20,21]. The 0.4 mm cell culture inserts (Becton Dickinson) were coated with 0.01% type I rat tail collagen (Sigma) and UV sterilised.
The Caco-2 cells were cultured for 21 days to enable enterocytic differentiation.
The electrical resistance of the monolayer (TER) was measured using an EVOM epithelial voltmeter with chopstick electrodes (World Precision Instruments Ltd., Aston, UK).
Upon stabilisation of TER, the media in the apical layer was removed and replaced with fluorescein enriched media containing the range of SHIME supernatant treatments and controls. Concentrations of ethanol (5.7%) and propionate (10 mM), that were known to decrease and increase TER, respectively, were used as positive controls.
TER and basolateral fluorescein measurements were recorded at 0 h and 24 h to determine monolayer resistance and paracellular perme-ability, respectively. Each treatment was carried out in duplicate and the experiment repeated independently 3 times.


2.5.4. The Comet assay (single cell gel electrophoresis)
The antigenotoxicity of all fermentation supernantant samples were assessed by their ability to decrease DNA damage in Caco-2 cells induced by oxidative challenge with H2O2 (75 mM).
This method was adapted from Gill et al. [19].
In brief, Caco-2 cells were seeded for 24 h followed by treatment with SHIME supernatant for 24 h.
The cells were then trypsinised, counted, exposed to PBS or H2O2 (75 mM) for 5 min on ice, centrifuged and subsequently immersed in low melting point agar and placed on a bed of normal melting point agar gel.
The cells were then placed in lysis buffer (1 h), immersed in electrophoresis buffer for 20 min followed by electrophoresis (26 V, 300 mA) for 20 min.
The gels were then washed in neutralising buffer for 5 min (3) and stained with ethidium bromide.
DNA damage, as measured by tail intensity, was subsequently quantified using an epi-fluorescent microscope and Komet 3.0 image analysis software (Kinetic Imaging Ltd, UK).
Each treatment was carried out in triplicate and the experiment repeated independently 3 times.


3. Results
3.1. SHIME
3.1.1. Bacterial populations

Viable counting on selective growth media was used to inves-tigate the microbial composition of the SHIME liquid from the different vessels throughout the SHIME experiment.
During the studies with AGV there were no marked changes in the number of total anaerobic bacteria between the 3 phases of the SHIME runs PRE, AGV or POST in any of the colonic vessels (Table 1).
AGV treatment increased bifidobacteria populations in all 3 vessels, with significant increases in the ascending and transverse SHIME vessels (P < 0.05).
In contrast to the other groups of or-ganisms investigated, the number of bifidobacteria returned to PRE values when the AGV was removed and significant differences were noted between AGV and POST periods in all 3 vessels (P < 0.05).

Lactobacilli populations were also stimulated during Agave treat-ment ment in all 3 vessels, with numbers declining again during the POST period, however no significant differences were noted (Table 1).

Table 1 Bacterial composition of SHIME sample obtained from the proximal, transverse and distal colonic vessels of the SHIME reactor during the PRE (n ¼ 6), AGV (n ¼ 8) and POST (n ¼ 6) periods.


3.2. Short chain fatty acids
3.2.1. Proximal colon vessel (Table 2)
Supplementation with AGV resulted in an increase of total SCFA concentration from 42.73 mM during PRE to 49.84 mM (P < 0.01) which persisted throughout the POST period at 52.51 (P < 0.05).
Acetic acid concentrations significantly increased from 24.97 mM in PRE to 27.50 mM (P < 0.01) during treatment and levels remained elevated during the POST period at 29.81 mM (P < 0.01).
Propionate showed an increase from 10.81 mM in PRE to 12.59 mM during treatment (P < 0.05) which remained elevated (12.56 mM) throughout the POST period (P < 0.01). While butyric acid showed a substantial elevation from 4.98 mM during PRE to 7.53 mM during treatment (P < 0.01) which remained relatively high at 7.73 mM (P < 0.01)compared to PRE.

3.2.2. Transverse colon vessel (Table 2)
An increased total SCFA was observed in the transverse colon,rising from 51.03 mM during the PRE period to 58.81 mM during the treatment (P < 0.05), and this increase elevated to 61.02 mM (P < 0.01) during the POST period. Acetic acid was increased from 28.65 mM during the PRE to 31.74 mM during treatment (P < 0.01), and continued to rise throughout the POST period to 33.57 mM (P < 0.01).
Propionic acid concentrations slightly increased from PRE values of 14.19 mMe16.48 mM during treatment (P < 0.01) and remained relatively stable throughout the POST period (15.59 mM).
Butyric acid increased from 5.59 mM during PRE to 7.77 mM (P < 0.01) during treatment and continued to increase throughout the POST period (P < 0.01) reaching 8.81 mM.

3.2.3. Distal colon vessel (Table 2)
Total SCFA concentrations increased from 57.54 mM to 63.05 mM during treatment and continued to increase during the POST period peaking at 65.88 mM (P < 0.05). Acetic acid slightly increased from 33.40 mM to 34.90 mM and remained high during the POST period 36.62 mM (P < 0.01). Propionic acid increased from 15.21 mM during the PRE to 16.52 mM through treatment (P < 0.05) and regressed slightly to 16.30 mM (P < 0.01). Butyric acid concentrations increased from 6.12 mM during PRE to 8.46 mM (P < 0.01) during treatment and increased further to 9.56 (P < 0.01) during the POST period.

3.2.4. Ammonia (Table 2)

AGV treatment did not significantly change ammonia concen-tration in the PV or TV, however it significantly decreased ammonia concentration in the distal colon (27.00 mMe25.60 mM, P < 0.01)
with both returning to close to PRE levels during the POST period.


3.3. Anticancer bioactivity of SHIME supernatants
3.3.1. TER assay (Fig. 2)

The control treatments for the TER experiments gave the ex-pected results: propionate increased TER at 24 h (20.31 3.3,P < 0.01) in relation to its value at 0 h, whereas ethanol decreased TER (54.67% 4.0, P < 0.001) which was significantly different from the media control.

The samples from the proximal SHIME vessel, after AGV treat-ment caused an increase in TER over 24 h (12.7% 3.13, P < 0.05)

which was significantly different from both PRE (4.5% 1.25) and POST (7.9% 1.62).
AGV treatment showed a significant decrease in fluorescein flow compared to PRE at 24 h (19.3 8.55, P < 0.05)
which is in agreement with the changes in TER.
Despite an elevated TER after AGV treatment of 11.06% 2.76 in the transverse vessel this did not reach statistical significance compared to the changes apparent in the PRE (4.55% 2.75) or post treatment (4.64% 4.34).
However, AGV treatment supernatant from the distal SHIME vessel significantly increased TER (17.2% 5.60, P < 0.05) relative to cor-responding PRE (10.0% 4.07) and POST (9.0% 11.93) samples.
The TER changes observed in the media control after 24 (6% 5.23) and 48 h (1.24% 0.91) did not significantly differ from the TER at 0 h.


3.3.2. Cytotoxicity and Comet assays
The MTT assay showed no cytotoxic effects of any of the SHIME
supernatants from any of the vessels.
When challenged with 75 mM H2O2 the DNA damage (% tail DNA) induced in Caco-2 cells averaged 52.93% 0.92 in the negative control.
No significant anti-genotoxic effect was observed in any of the treatment supernatant samples when pre-incubated for 24 h with Caco-2 cells.
Genotoxicity was not significantly different in any of the SHIME treatment samples compared to the negative media control (data not shown).

4. Discussion
The high mortality and risk of colorectal cancer and the modi-fiable nature of the disease particularly through diet highlights a need to identify dietary components to decrease risk [22].
Pre-biotics, inulin-type prebiotics in particular, are emerging as a food ingredient which can positively influence the intestinal microbiota composition and metabolism and have been shown to beneficially alter biomarkers of colon cancer in in-vitro and in-vivo studies [6].
Recent studies have also implicated faecal transplantation as a method to alter the gut microbiota to benefit health, however this research approach is in its infancy and usually only applicable for high risk individuals [23].
Continuous culture systems simulate the environmental conditions of the different colonic segments found in-vivo and enable changes of regional luminal contents to be investigated in a manner which is not possible in normal human intervention studies [10,16].
Several studies have investigated the relationship between DP and fermentation dynamics of linear inulin [9,10], however there is a paucity of data on the influence of branched inulin on microbiota composition and fermentation and the associated health benefits.
The findings from our study have demonstrated that branched Agave fructans exert significant bifidogenic activity alongside significantly elevated SCFA production (butyrate in particular) and reductions in ammonia production. Moreover, significant increases in bifidobacteria were noted in the simulated PV and TV of the SHIME and although there was an increase in the DV, it failed to reach significance.
The results obtained from this continuous cul-ture study confirm the stimulatory effect of AGV on bifidobacteria populations alongside the increase in short chain fatty acids observed in the batch culture study by Gomez et al. [15].
However,the increases of lactobacilli populations in our study in all 3 SHIME vessels failed to reach the statistical significance, unlike the Gomez et al. study.
The current study has provided additional information on the fermentation activity along the simulated colon. Previous studies have consistently shown prebiotics to selectively increase bifidobacteria and lactobacilli and these bacteria populations and their fermentative activities have been suggested to be responsible for modulation of the microbiota leading to a range of health benefits [24].
The noted pop-ulation increases of these groups following AGV treatment would implicate Agave as an alternative source to chicory for inulin-type prebiotics.
However, more work is needed to investigate the particular species that benefit from AGV supplementation and future work using pyrosequencing technologies could provide pivotal in-formation regarding the more intricate changes of the microbiota [25].
Short chain fatty acids (SCFA) are a major product of prebiotic fermentation and increased colonic concentration of these com-pounds (acetate, propionate and butyrate) has been attributed to the health benefits of inulin [26].
This study demonstrated signif-icant increases in SCFA’s with notable increases in the proportion of butyrate in all 3 vessels provide indications of enhanced saccha-rolytic fermentation.
Butyrate is a compound of critical importance in the colon, with multiple roles including the provision of 70% of the colonocytes metabolic needs, controlling normal colonic mucosal homeostasis through its proliferative and apoptotic ac-tivities in healthy and transformed tissue, respectively [27], as well as its immunomodulatory activity through its histone deacetylase inhibitory activity on NFkB expression [28].
The butyrigenic effect of AGV is a desirable observation and has been suggested to be a major contributor to prebiotic-mediated health benefits on colon health [29].
Previous SHIME experiments investigating the prebi-otic activity of linear inulin exhibited similar activity [8].
The reversible and significant decrease in ammonia alongside enhanced SCFA apparent in the distal vessel may be due to enhanced sac-charolytic fermentation at the expense of proteolytic fermentation.

The reduced exposure of ammonia to the colonocytes following prebiotic supplementation has been attributed to increased ammonia assimilation by bacteria, and the protective effects of butyrate have also been suggested to be responsible for reducing ammonia mediated toxicity [30,31].
The observed reduction in ammonia alongside the elevated bifidobacteria populations and short chain fatty acid production during AGV treatment indicates a degree of shift from proteolytic fermentation to saccharolytic fermentation, this is particularly important in the distal vessel where proteolytic fermentation predominates leading to the accumulation of toxic metabolites.

Barrier function of the colonic mucosa is critical to the main-tenance of health and immunity of the human host [32].
Loss of barrier function has been attributed as a key factor in the patho-genesis of many gastrointestinal disorders including inflammatory bowel disease and the promotion of colon cancer [33e35].
Despite a range of suggested mechanisms to implicate a role of mucosal barrier function in colon cancer promotion, the exact pathological consequences of altered gut permeability on the process of carci-nogenesis have not been fully elucidated [36,37].
Gill et al. showed using a caco-2 barrier function model that the faecal water of healthy adults improves barrier function whilst that of the elderly impaired it, suggesting faecal water as a putative marker to deter-mine age-related alteration of barrier function [20].
imilar ex-vivo models have been used to investigate the influence of dietary components and metabolites on barrier function, such as pro-biotics, prebiotics, butyrate and vitamin D, which have all been shown to improve barrier function [38e42].
The use of these ex-vivo and in-vivo models could help in the identification of dietary components that alter barrier function to enable the development of dietary strategies towards preventing age-related barrier impairment and reducing the risk of associated diseases.
The cur-rent study used the Caco-2 barrier function model to investigate the influence of AGV fermentation supernatant.
This study demonstrated that AGV fermentation supernatant from all SHIME vessels resulted in elevated monolayer resistance although only significant differences were noted in the proximal and distal colon, and these results were corroborated, in part, by the fluorescein results.
The complexity and diversity of metabolites within the SHIME supernatants makes it difficult to conclusively identify the contributing compounds associated with the observed bioactivity.
However, a potential mechanism for the increase in barrier function is the elevated SCFA concentration (especially that of butyrate) seen in the AGV fermentation supernatants [38,43e45].
Butyrate is thought to act via up-regulating tight junction proteins or influ-encing their assembly. In contrast to the effect on barrier function,no protective effects were observed against DNA damage, the other cancer biomarker tested.
Interestingly, beneficial effects on geno-toxicity have been reported for certain prebiotics in animal and human studies [45,46] and for probiotic/prebiotic mixtures in humans [42] with increased SCFA concentrations, particularly butyrate, implicated in antigenotoxic activity [44].
This study has demonstrated that AGV specifically stimulated bifidobacteria populations in a human colonic model, without changes in total bacterial numbers, as well as increasing SCFA concentrations.
In combination with the demonstrated enhance-ment in barrier function in-vitro, these results strongly suggest that AGV have prebiotic potential, which needs to be confirmed in placebo controlled human dietary intervention studies.
Acknowledgements This project was carried out with the financial support from the Northern Ireland Department of Education and Learning and The Rank Prize Fund travel grant.





♥ เรื่อง Anaerobe (บัคเตรีจำพวกที่ไม่ต้องการออากาศหายใจ)

พรีไบโอติกชนิดอินดุลินชนิด frostan (ITF) มีบทบาทสมมุติในการป้องกันโรคมะเร็งลำไส้ใหญ่และทวารหนัก
การศึกษานี้มีวัตถุประสงค์เพื่อศึกษาสมบัติการหมักและกิจกรรม prebiotic ที่มีศักยภาพของ fructans ที่แยกได้จาก Agave angustifolia Haw โดยใช้แบบจำลอง Simulator of Human Intestinal Microbial Ecosystem (SHIME)
การตรวจสอบการหมัก fructan ในลำไส้ใหญ่และลำไส้ใหญ่เพื่อประเมินการเปลี่ยนแปลงขององค์ประกอบของจุลินทรีย์และสารอาหารการหมัก (กรดไขมันสายสั้นและแอมโมเนีย)
มีอิทธิพลต่อการออกฤทธิ์ทางชีวภาพของสารละลายหมักโดยใช้ MTT, Comet และ transepithelial electrical resistance (TER) ตามลำดับ
การเติม Agave fructan ลงในแบบจำลอง SHIME

เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (P <0.05), ประชากร bifidobacteria (proximal และ poprze), SCFA concen-trations (proximal, transverse และ distal) และลดความเข้มข้นของแอมโมเนียในเรือไกล

นอกจากนี้ยังพบว่าสาหร่ายเพาะจากการหมักมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญยิ่งทางสถิติ (P <0.05) เพิ่มความสามารถในการย่อยสลายเซลลูโลสของเซลล์ Caco-2 (%) และลดการไหลเวียนของพาราซัลลัสที่ลดลงของ fluorescein
ในขณะที่ความเป็นพิษต่อเซลล์และความเป็นพิษของยีนยังคงไม่เปลี่ยนแปลงเมื่อตอบสนองต่อการปรากฏตัวของ Agave fructans
สรุป Agave ที่แยกได้

fructans แสดงข้อบ่งชี้ของกิจกรรม prebiotic โดยเฉพาะอย่างยิ่งในความสัมพันธ์กับสุขภาพลำไส้ใหญ่โดยการมีอิทธิพลในเชิงบวกต่อการทำงานของกั้นทางเดินอาหารที่สำคัญของการเกิดมะเร็งลำไส้ใหญ่


1. บทนำ
microbiota ลำไส้ใหญ่ยังคงได้รับความสำคัญเป็นแหล่งของปัจจัยที่เอื้อต่อการเกิดโรคและสาเหตุของโรคหลายชนิดเช่นมะเร็งลำไส้ใหญ่ [1]
การระบุองค์ประกอบทางโภชนาการที่มีผลต่อการมีสุขภาพดีของลำไส้ใหญ่โดยการปรับเปลี่ยนของ microbiota เป็นกลยุทธ์ที่มีประโยชน์ในการลดความเสี่ยงต่อมะเร็งลำไส้ใหญ่ [2,3]
พรีไบโอติกกลายเป็นส่วนผสมของอาหารที่มีประโยชน์ต่อสุขภาพโดยการกระตุ้นแบคทีเรียที่เป็นประโยชน์ (bifidobacteria / lactobacilli) และสารที่ทำให้เกิดการ saccharolytic metabolites (SCFA's โดยเฉพาะอย่างยิ่งที่มีมัย) [4]
กลไกเชิงกลที่รับผิดชอบต่อกิจกรรมต้านมะเร็ง prebiotic-mediated รวมถึงการปรับปรุงการทำงานของกั้นลำไส้ใหญ่และการป้องกัน geno ที่เพิ่มขึ้นอันเป็นผลมาจากกิจกรรมที่มีฤทธิ์ใน butyrate [4.5]
ฟรุกโตแมนชนิดอินนูลิน (ITF) เป็นนักวิจัยที่ได้รับการยอมรับว่าเป็นผู้ที่มี prebiotic ส่วนใหญ่ศึกษาค้นคว้าเพื่อแสดงถึงประโยชน์ต่อสุขภาพในวงกว้าง [6] prebiotics ของเอนไซม์ ITF มีผลกระตุ้นต่อประชากร bifidobacterial อย่างต่อเนื่องควบคู่ไปกับการเพิ่มขึ้นของผลิตภัณฑ์ fermen-tation ที่เกี่ยวข้องกับ saccharolytic เช่นกรดไขมันสั้นในสัตว์และมนุษย์ [7]
อัตราและขอบเขตของการหมักของ ITF มีอิทธิพลอย่างมากจากระดับของพอลิเมอไรเซชัน (DP)
Fructooligosaccharides - FOS (low DP) ได้รับการหมักอย่างรวดเร็วในลำไส้ใหญ่ส่วนปลาย [8] ในขณะที่ inulin (high DP) มีลักษณะการหมักที่ยั่งยืนมากขึ้นซึ่งอาจทำให้เกิดการป้องกันผลกระทบในพื้นที่ห่างไกลของลำไส้ใหญ่ได้ [9, 10]
ควรให้อาหารเสริม prebiotic เพื่อกระตุ้นการทำงานของแบคทีเรียในกระเพาะอาหารให้สม่ำเสมอทั่วทั้งลำไส้ใหญ่โดยเฉพาะลำไส้เล็กส่วนปลายที่การหมัก proteolytic มีส่วนสำคัญและเกี่ยวข้องกับการผลิตสารพิษเช่น แอมโมเนียไฮโดรเจนซัลไฟด์และครีซอล [11,12]
มีข้อเสนอแนะว่าสารฟรุคัตชนิดอื่น ๆ โดยเฉพาะ Agave ที่ได้รับ fructans (AGV) ซึ่งเป็นที่นิยมในอดีตโดยประชากรเชื้อสายในอเมริกากลางอาจนำเสนอผลประโยชน์ที่คล้ายคลึงกันหรือปรับปรุงให้กับสุขภาพลำไส้ใหญ่ของมนุษย์ [13] AGV มีโครงสร้าง fructan ที่แยกได้ด้วยทั้งสองสายโซ่ fructosyl ที่เชื่อมโยงกับ b (1e2) และ b (2e6) ติดกับหน่วยเริ่มต้นของซูโครสขณะที่ ITF ถูก จำกัด ไว้ที่โครงสร้างเชิงเส้นที่มีส่วนเชื่อมโยง b (1e2) [14]
มีการตั้งสมมติฐานว่าการแยกโครงสร้างของ Agave fructans อาจส่งผลให้เกิดรูปแบบการหมักแบบทดแทนและยั่งยืนขึ้นกว่า ITF เชิงเส้น

นำไปสู่การเพิ่มขึ้นของการหมัก saccharolytic ที่ค่าใช้จ่ายของการหมัก proteolytic ในลำไส้ใหญ่ไกล
นอกจากนี้จะช่วยให้ผลป้องกันที่กระทำโดย prebiotics ใน proximal colon จะแสดงในลำไส้ใหญ่ส่วนปลาย
การศึกษาล่าสุดโดย Gomez et al. ได้แสดงให้เห็นกิจกรรม prebiotic ของ fructans จาก Agave tequiliana ในการศึกษาการเพาะเลี้ยงแบบแบทช์และการศึกษาในปัจจุบันนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อให้ข้อมูลเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงการหมักของ fructans จาก Agave angustifolia ในบริเวณต่างๆของลำไส้ใหญ่ [15]
ในการศึกษานี้จะมีการศึกษาประสิทธิภาพของพรีไบโอติคโดยใช้ระบบนิเวศจุลินทรีย์ในระบบจุลินทรีย์ในลำไส้จำลองของมนุษย์ (SHIME) แบบต่อเนื่องซึ่งก่อนหน้านี้เคยใช้เพื่อระบุลักษณะการหมักของคาร์โบไฮเดรต prebiotic อื่น ๆ


นำไปสู่การเพิ่มขึ้นของการหมัก saccharolytic ที่ค่าใช้จ่ายของการหมัก proteolytic ในลำไส้ใหญ่ไกล
นอกจากนี้จะช่วยให้ผลป้องกันที่กระทำโดย prebiotics ใน proximal colon จะแสดงในลำไส้ใหญ่ส่วนปลาย
การศึกษาล่าสุดโดย Gomez et al. ได้แสดงให้เห็นกิจกรรม prebiotic ของ fructans จาก Agave tequiliana ในการศึกษาการเพาะเลี้ยงแบบแบทช์และการศึกษาในปัจจุบันนี้มีวัตถุประสงค์เพื่อให้ข้อมูลเกี่ยวกับการเปลี่ยนแปลงการหมักของ fructans จาก Agave angustifolia ในบริเวณต่างๆของลำไส้ใหญ่ [15]
ในการศึกษาครั้งนี้จะมีการศึกษาประสิทธิภาพของพรีไบโอติคโดยใช้ระบบนิเวศจุลินทรีย์ในระบบจุลินทรีย์ในลำไส้จำลอง (SHIME) ของระบบสืบพันธุ์ต่อเนื่องซึ่งก่อนหน้านี้ได้ถูกนำมาใช้เพื่อระบุลักษณะการหมักของคาร์โบไฮเดรตและ prebiotic e inulin และ FOS [10,16]
นอกจากนี้เราจะตรวจสอบกิจกรรมการต้านมะเร็งของสารละลายหมักที่ใช้ biomarkers ช่วงที่มีส่วนเกี่ยวข้องกับการมีบทบาทในการเกิดมะเร็งในลำไส้ใหญ่


2. วัสดุและวิธีการ
2.1 การสกัด Agave fructan
Agave fructans ได้รับจาก Mercantil Orgánica S.A de C.V. ผู้จัดจำหน่าย fructan ในเม็กซิโก
ผลิตภัณฑ์ฟรุ๊ตทรานได้รับจากลำต้นอายุ 7 ปีขึ้นไป
A. angustifolia Haw พืช
ลำต้นถูกหั่นเป็นชิ้นเล็กชิ้นน้อยกดเพื่อดึงน้ำผลไม้ของพวกเขาและล้างด้วยน้ำร้อนที่อุดมสมบูรณ์ (60 องศาเซลเซียส) เพื่อเพิ่มการกู้คืน
จากนั้นนำน้ำที่ผ่านการกรองแล้วกรองกรอง deionised เข้มข้นและสุดท้ายให้พ่นแห้งเพื่อให้ได้ผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้าย
ผลิตภัณฑ์เชิงพาณิชย์นี้มีส่วนประกอบของคาร์โบไฮเดรต> fructans 96% และ <4% ของ monosaccharides (ฟรุกโตส / กลูโคส) และค่าเฉลี่ย DP ที่ 16 ซึ่งได้รับบริจาคจาก Dr. IvánSaldañaOyarzábal


2.2 ระบบวัฒนธรรม SHIME
แบบจำลอง SHIME ซึ่งดัดแปลงมาจาก Molly et al. [17] เป็นแบบไดนามิก 5 รูปแบบเรือของระบบทางเดินอาหารผู้ใหญ่ของมนุษย์ที่มีเวลาเก็บรักษารวม 76 ชั่วโมง
เรือ 1 และ 2 มีจุดมุ่งหมายเพื่อสร้างแบบจำลองของกระเพาะอาหารและลำไส้เล็กด้วยหลอดเลือด 3, 4 และ 5 แบบจำลองลำไส้ใหญ่ลำไส้ใหญ่และลำไส้ใหญ่ตามลำดับ
เรืออาณานิคมของ SHIME ได้รับเชื้อด้วยอุจจาระของอาสาสมัครชายหนุ่มที่เป็นผู้ใหญ่ (โดยได้รับความยินยอมเป็นลายลักษณ์อักษรและได้รับความยินยอม) โดยไม่มีประวัติการรักษายาปฏิชีวนะหรือ colonic disor-ders ประมาณ 6 เดือนก่อนการศึกษา
การศึกษานี้ได้รับการอนุมัติจากคณะกรรมการจริยธรรมของโรงพยาบาลมหาวิทยาลัยเกิร์น (เลขทะเบียนของประเทศเบลเยี่ยม B670201214538)
จากนั้นนำตัวอย่างอุจจาระที่ถูกกลืนหายไปและเจือจางด้วยบัฟเฟอร์ฟอสเฟต (0.1 โมล / ลิตร pH 7) (10% w / v) และทำการกำจัดชิ้นส่วนโดยการหมุนเหวี่ยง (ที่ 50,000 กรัมเป็นเวลา 5 นาที) 50 มล. นำเข้ามาในแต่ละลำไส้ SHIME
การเลี้ยงด้วยจุลินทรีย์เป็นเวลา 2 สัปดาห์สำหรับอาหารที่ใช้คาร์โบไฮเดรต [17] และสามารถปรับตัวให้เข้ากับสภาวะแวดล้อมที่เฉพาะเจาะจงของลำไส้ใหญ่ขึ้น, ลงบนและลงไปได้ในช่วง pH, เวลาเก็บรักษาและคาร์บอนที่มีอยู่ แหล่งที่มา
ในช่วงระยะเวลาการควบคุมก่อนการบำบัด (PRE) SHIME ได้รับการเสริมด้วยอาหารโภชนาการมาตรฐานเป็นเวลา 2 สัปดาห์แรกของการทดลอง
จากนั้นจึงเริ่มทำการทดลองด้วย Agave fructan (AGV) 3 สัปดาห์โดยให้สื่อมาตรฐาน (ซึ่งให้แป้ง 2 กรัม / ตัว) ถูกแทนที่ด้วยอาหารทดลองที่แป้งถูกแทนที่ด้วย AGV (2 กรัมต่อวัน) (รูปที่ 1) .
สื่อการทดลองของ Agave มีปริมาณเท่ากับ 4 กรัมต่อวันซึ่งเป็นปริมาณที่แสดงให้เห็นว่าไม่ได้มีผลเสียต่อการศึกษาของมนุษย์
การเปลี่ยนแป้งกับ fructans ในอาหารโภชนาการทำให้ปริมาณคาร์โบไฮเดรตที่มีอยู่สำหรับจุลินทรีย์ยังคงไม่เปลี่ยนแปลงตลอดระยะเวลาทดลอง SHIME หลังจากช่วงเวลาในการเก็บรักษา AGV สื่อโภชนาการที่ใช้แป้งแล้วได้รับการแนะนำให้ใช้อีกครั้งในระยะเวลาการรักษาหลังการรักษา 2 สัปดาห์ (POST) เพื่อตรวจสอบว่าพารามิเตอร์ของจุลินทรีย์และการเผาผลาญอาหารกลับมาอยู่ในระดับ PRE หรือไม่

2.3 คอลเลกชัน SHIME
การหมักแบบ AGV ใช้แบบจำลอง SHIME และตัวอย่างจากเรือ 3 (proximal colon PV), เรือ 4 (trans-verse colon TV) และเรือ 5 (distal colon DV) ในช่วง PRE, AGV และ POST
ตัวอย่างถูกนำมาและนำมาใช้โดยตรงสำหรับการวิเคราะห์ mi-crobial และ metabolic หรือเก็บไว้ที่อุณหภูมิ 80 องศาเซลเซียสสำหรับการทดสอบในภายหลัง
2.4 Microbiota และการวิเคราะห์กิจกรรมการเผาผลาญอาหาร
2.4.1 การวิเคราะห์ชุมชนจุลินทรีย์
การหาปริมาณของกลุ่มแบคทีเรียที่ใช้การนับแผ่นถูกดัดแปลงมาจาก Van de Wiele et al. (Oxoid, Hampshire, UK): lactobacilli (Rogosa agar), bifidobacteria (raffinose Bifidobacterium agar), enterococci (Enterococcus agar), enter-obacteria (MacConkey agar) โดยเฉพาะอย่างยิ่งเมื่อมีการใช้งาน และ clostridia (tryptose sulfite cyclo-serin agar)


2.4.2 กรดไขมันสายสั้น
ตัวอย่างจากหลอดเลือด 3 ลำ 'ถูกเก็บและแช่แข็งที่อุณหภูมิ 20 องศาเซลเซียสสำหรับการวิเคราะห์ในภายหลัง พบกรดไขมันชนิดสั้น (Short-chain fatty acids - SCFA) จากตัวอย่างที่สกัดด้วยอีเทอร์ไดเอทิล (Sigma)
(GC; Shimadzu's Hertogenbosch, The Netherlands) ตามที่อธิบายไว้ใน Possemiers et al.
[18]

2.4.3 สารแอมโมเนีย
โปรโตคอลถูกดัดแปลงมาจาก Van de wielu et al. [17]
สรุปโดยใช้เครื่องกลั่นอัตโนมัติ 1026 Kjeltec (FOSS Benelux, Amers foort, The Netherlands) แอมโมเนียมในตัวอย่างถูกปลดปล่อยเป็นแอมโมเนียด้วยการเติมด่าง (MgO) แอมโมเนียที่ปล่อยออกมาถูกกลั่นจากตัวอย่างลงในสารละลายกรดบอริก
การแก้ปัญหานี้ใช้วิธี Dosimat 665 (Metrohm, Berchem, Belgium) และ Titroprocessor 686 (Metrohm)

2.5 การหมักเพาะเชื้อโรคในลำไส้เล็กส่วนปลาย (PV) ลำไส้ใหญ่ขวาง (TV) และลำไส้ใหญ่ส่วนปลาย (DV) ที่เก็บตัวอย่างในช่วง PRE, AGV และ POST เก็บที่อุณหภูมิ 80 องศาเซลเซียส
เตรียมสารละลายหมักที่เตรียมไว้ด้วยการหมุนเหวี่ยงหมักดองที่อุณหภูมิ 50000 กรัม (Beckman Ultracentrifuge XL-70, Beckman Instruments, Inc. , California, USA) ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 ชั่วโมง

Supernatants ถูกกรองฆ่าเชื้อโดยใช้ตัวกรองหลอดฉีดขนาด 0.45 มม. และ 0.2 มิลลิเมตร (Minisart, Vivascience AG, Hannover, Germany) และเก็บที่อุณหภูมิ 80 องศาเซลเซียส

2.5.1 การเพาะเลี้ยงเซลล์
เซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่ของมนุษย์ Caco-2 (colorectal adenocar-cinoma) ได้มาจาก European Collection of Cell Cultures และใช้ระหว่างทางเดิน 50e60 (Salisbury, UK)
เซลล์ Caco-2 ถูกเพาะเลี้ยงในอาหารที่มีความจำเป็นขั้นต่ำ (MEM), ซีรั่มสุกรตัวอ่อนของทารกในครรภ์ 10%, penicillin streptomycin 1% และกรดอะมิโนที่ไม่จำเป็น 1%
วัสดุเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อทั้งหมดถูกซื้อมาจาก Gibco (Paisley, UK)

2.5.2 การตรวจ cytotoxicity เซลล์ (MTT)
supernatants หมัก SHIME ได้รับการประเมินความเป็นพิษต่อเซลล์ในเซลล์ Caco-2 โดยใช้ 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) assay
วิธีนี้ได้รับการดัดแปลงมาจาก Gill et al. [19] และความเป็นพิษของตัวอย่างทดสอบที่จะนำมาเปรียบเทียบกับสื่อ (ไม่ได้รับการรักษา) และการควบคุมในเชิงบวก (deoxy-cholic acid 250/500 mM)
ทำการทดลองในบ่อละ 8 ครั้งและทำการทดลองซ้ำ 3 ครั้ง


2.5.3 การตรวจวัดความต้านทานไฟฟ้าผ่านทางช่องท้อง (TER)
วิธีการที่ใช้ในการศึกษานี้ถูกปรับเปลี่ยนจาก Gill et al. และ
McGilligan et al. [20,21] ตัวแทรกซึมเซลล์เพาะเลี้ยงขนาด 0.4 มม. (Becton Dickinson) เคลือบด้วยคอลลาเจนชนิดหางยาว I (Sigma) 0.01% และฆ่าเชื้อด้วยรังสีอัลตราไวโอเลต
เซลล์ Caco-2 ถูกเพาะเลี้ยงเป็นเวลา 21 วันเพื่อให้เกิดความแตกต่างของ enterocytic
ความต้านทานไฟฟ้าของ monolayer (TER) วัดโดยใช้โวลต์มิเตอร์แบบ EVOM ที่มีขั้วไฟฟ้าตะเกียบ (World Precision Instruments Ltd. , Aston, UK)
เมื่อทำการรักษาเสถียรภาพของ TER สื่อในชั้นยอดจะถูกลบออกและถูกแทนที่ด้วยสื่อที่ได้รับรังสีอัลตราซาวส์ที่มีช่วงของการบำบัดและการควบคุมเหนือชั้นของ SHIME ความเข้มข้นของเอทานอล (5.7%) และ propionate (10 mM) ซึ่งเป็นที่รู้กันว่าลดลงและเพิ่ม TER ตามลำดับใช้เป็นตัวควบคุมในเชิงบวก
การวัดค่าความเป็นกรด - ด่างและ basosphere fluorescein วัดที่ 0 h และ 24 h เพื่อหาค่าความต้านทานต่อชั้นเดียวและความสามารถในการดูดซับของพาราซัลลัสตามลำดับ การทดลองแต่ละครั้งดำเนินการซ้ำ ๆ กันและทำการทดลองซ้ำสามครั้ง


2.5.4 การวิเคราะห์ดาวหาง (single cell gel electrophoresis)
ความสามารถในการลดการทำลายดีเอ็นเอในเซลล์ Caco-2 ที่เกิดจากความท้าทายในการออกซิเดชั่นกับ H2O2 (75 มม.) มีการประเมินความเป็นพิษต่อแอนติเจนของตัวอย่างซูเปอร์โนซานทินทั้งหมด
วิธีนี้ได้รับการดัดแปลงมาจาก Gill et al. [19]
ในระยะสั้นเซลล์ Caco-2 ถูกเพาะพันธุ์เป็นเวลา 24 ชั่วโมงตามด้วยการรักษาด้วย supernatant SHIME เป็นเวลา 24 ชั่วโมง
จากนั้นนำเซลล์ที่ถูกตรึงไว้ให้นับ PBS หรือ H2O2 (75 ม.ม. ) เป็นเวลา 5 นาทีบนน้ำแข็งหยงและหดตัวต่อไปในสารละลายที่มีจุดหลอมเหลวต่ำและวางลงบนเตียงเจลเจลละลายตามปกติ
เซลล์ถูกเก็บไว้ในบัฟเฟอร์ lysis (1 ชั่วโมง) แช่ในบัฟเฟอร์ electrophoresis เป็นเวลา 20 นาทีตามด้วย electrophoresis (26 V, 300 mA) เป็นเวลา 20 นาที
เจลล้างด้วยน้ำยากันสนิทเป็นเวลา 5 นาที (3) และย้อมสีด้วย ethidium bromide
ความเสียหายของดีเอ็นเอโดยวัดจากความเข้มของหางโดยใช้กล้องจุลทรรศน์ epi-fluorescent และซอฟต์แวร์วิเคราะห์ภาพ Komet 3.0 (Kinetic Imaging Ltd, UK)
การทดลองแต่ละครั้งดำเนินการเป็นสามเท่าและทำการทดลองซ้ำ 3 ครั้ง


3. ผลลัพธ์
3.1 SHIME
3.1.1 แบคทีเรียประชากร

เมื่อใช้สื่อการเจริญเติบโตที่คัดเลือกแล้วจะนำไปใช้ในการตรวจสอบองค์ประกอบของจุลินทรีย์ของของเหลว SHIME จากภาชนะต่างๆตลอดการทดลอง SHIME
ในระหว่างการศึกษากับ AGV ไม่มีการเปลี่ยนแปลงที่ชัดเจนของจำนวนแบคทีเรียที่ไม่ใช้ออกซิเจนทั้งหมดระหว่าง 3 ขั้นตอนของ SHIME ใช้ PRE, AGV หรือ POST ในลำไส้ใหญ่ใด ๆ (ตารางที่ 1)
การรักษาด้วย AGV เพิ่มจำนวนเชื้อแบคทีเรียกลุ่ม bifidobacteria ทั้ง 3 ลำเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (P <0.05)
จำนวนแบคทีเรียแบคทีเรียกลับมาอยู่ในค่า PRE เมื่อกำจัด AGV และมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญระหว่างช่วง AGV และ POST ในทั้ง 3 หลอด (P <0.05) เมื่อเปรียบเทียบกับกลุ่มอื่น ๆ

ประชากร Lactobacilli ได้รับการกระตุ้นด้วย Agave ในการรักษาทั้ง 3 ลำโดยตัวเลขที่ลดลงอีกครั้งในช่วง POST อย่างไรก็ตามไม่พบความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (ตารางที่ 1)

ตารางที่ 1 องค์ประกอบแบคทีเรียของตัวอย่าง SHIME ที่ได้จากลำไส้เล็กส่วนต้นและส่วนปลายของเครื่องปฏิกรณ์ SHIME ในช่วง PRE (n ¼ 6), AGV (n ¼ 8) และ POST (n ¼ 6)


3.2 กรดไขมันสายสั้น
3.2.1 ลำไส้ใหญ่ส่วนปลาย (ตารางที่ 2)
การเสริมด้วย AGV ทำให้ความเข้มข้นของ SCFA เพิ่มขึ้นจาก 42.73 mM ในช่วง PRE ถึง 49.84 mM (P <0.01) ซึ่งยังคงอยู่ตลอดระยะเวลา POST ที่ 52.51 (P <0.05)
ความเข้มข้นของกรดอะซิติกเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญจาก 24.97 mM ใน PRE ถึง 27.50 mM (P <0.01) ในระหว่างการรักษาและระดับยังคงสูงในช่วง POST ที่ 29.81 mM (P <0.01)
Propionate เพิ่มขึ้นจาก 10.81 mM ใน PRE ถึง 12.59 mM ระหว่างการรักษา (P <0.05) ซึ่งยังคงสูง (12.56 mM) ตลอดระยะเวลา POST (P <0.01) ในขณะที่กรดบิวทิริกมีความสูงจาก 4.98 mM ในช่วง PRE ถึง 7.53 mM ระหว่างการรักษา (P <0.01) ซึ่งยังคงสูงอยู่ที่ 7.73 mM (P <0.01) เมื่อเทียบกับ PRE

3.2.2 เรือลำไยขวาง (ตารางที่ 2)
เพิ่มขึ้นจาก 51.03 mM ในช่วง PRE ถึง 58.81 mM ระหว่างการรักษา (P <0.05) และเพิ่มขึ้นเป็น 61.02 mM (P <0.01) ในช่วง POST กรดอะซิติกเพิ่มขึ้นจาก 28.65 mM ในช่วง PRE ถึง 31.74 mM ในระหว่างการรักษา (P <0.01) และยังคงเพิ่มขึ้นตลอดระยะเวลา POST เป็น 33.57 mM (P <0.01)
ความเข้มข้นของกรด Propionic เพิ่มขึ้นเล็กน้อยจากค่า PRE ที่ 14.19 mMe16.48 mM ในระหว่างการรักษา (P <0.01) และยังคงความเสถียรอยู่ในช่วง POST (15.59 mM)
กรดบิวทิริกเพิ่มขึ้นจาก 5.59 mM ระหว่าง PRE ถึง 7.77 mM (P <0.01) ในระหว่างการรักษาและยังคงเพิ่มขึ้นตลอดระยะเวลา POST (P <0.01) ถึง 8.81 mM

3.2.3 ลำไส้ใหญ่ส่วนปลาย (ตารางที่ 2)
ความเข้มข้นของ SCFA เพิ่มขึ้นจาก 57.54 mM เป็น 63.05 mM ระหว่างการรักษาและเพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่องในช่วง POST ที่มีค่าสูงสุดที่ 65.88 mM (P <0.05) กรดอะซิติกเพิ่มขึ้นเล็กน้อยจาก 33.40 mM เป็น 34.90 mM และยังคงสูงอยู่ในช่วง POST 36.62 mM (P <0.01) กรด Propionic เพิ่มขึ้นจาก 15.21 mM ในช่วง PRE ถึง 16.52 mM ผ่านการรักษา (P <0.05) และถดถอยเล็กน้อยเป็น 16.30 mM (P <0.01) ความเข้มข้นของกรดบิวทิลเพิ่มขึ้นจาก 6.12 mM ระหว่าง PRE ถึง 8.46 mM (P <0.01) ระหว่างการรักษาและเพิ่มขึ้นอีกเป็น 9.56 (P <0.01) ในช่วง POST

3.2.4 แอมโมเนีย (ตารางที่ 2)

การบำบัดด้วย AGV ไม่เปลี่ยนแปลงความเข้มข้นของแอมโมเนียใน PV หรือ TV แต่ลดความเข้มข้นของแอมโมเนียในลำไส้ใหญ่ส่วนปลาย (27.00 mMe25.60 mM, P <0.01)
ทั้งสองกลับมาใกล้เคียงกับระดับ PRE ในช่วง POST


3.3 ฤทธิ์ทางชีวภาพต้านมะเร็งของสารละลาย SHIME
3.3.1 TER (รูปที่ 2)

ผลการทดลองพบว่า propionate เพิ่ม TER ที่เวลา 24 ชั่วโมง (20.31 3.3, P <0.01) เมื่อเทียบกับค่าที่ 0 h ขณะที่เอทานอลลดลง TER (54.67% 4.0, P <0.001) ซึ่งแตกต่างจากการควบคุมสื่ออย่างมีนัยสำคัญ

ตัวอย่างจากเรือ SHIME ที่ใกล้เคียงหลังจากการบำบัด AGV ทำให้เกิดการเพิ่มขึ้นของ TER มากกว่า 24 ชั่วโมง (12.7% 3.13, P <0.05)

ซึ่งแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติกับ PRE (4.5% 1.25) และ POST (7.9% 1.62)
การบำบัดด้วย AGV ลดลงอย่างมีนัยสำคัญเมื่อเปรียบเทียบกับ PRE ที่เวลา 24 ชั่วโมง (19.3 8.55, P <0.05)
ซึ่งสอดคล้องกับการเปลี่ยนแปลง TER
แม้จะมีค่า TER สูงขึ้นหลังจากการรักษาด้วย AGV 11.06% 2.76 ในเรือขวางนี้ไม่ได้มีนัยสำคัญทางสถิติเมื่อเทียบกับการเปลี่ยนแปลงที่เห็นได้ชัดใน PRE (4.55% 2.75) หรือหลังการรักษา (4.64% 4.34)
อย่างไรก็ตามสารควบคุม AGV จากเรือ SHIME ที่เพิ่มขึ้นมีค่าเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (17.2% 5.60, P <0.05) เทียบกับกลุ่มตัวอย่างที่มีการตอบสนองต่อ PRE (10.0% 4.07) และ POST (9.0% 11.93)
การเปลี่ยนแปลง TER สังเกตในสารควบคุมสื่อหลังจาก 24 (6% 5.23) และ 48 h (1.24% 0.91) ไม่แตกต่างจาก TER ที่ 0 h อย่างมีนัยสำคัญ


3.3.2 Cytotoxicity และ Comet assays
การตรวจ MTT ไม่มีฤทธิ์เป็นพิษต่อเซลล์ของ SHIME
supernatants จากเรือใด ๆ
เมื่อทดสอบกับ 75 mM H2O2 ความเสียหายของดีเอ็นเอ (DNA tail DNA) ที่เกิดในเซลล์ Caco-2 เฉลี่ย 52.93% 0.92 ในการควบคุมเชิงลบ
ไม่มีผลต่อการต่อต้านยีนที่เป็นพิษอย่างมีนัยสำคัญในตัวอย่างใด ๆ ที่ได้รับการบ่มเชื้อเมื่อเตรียมตัวไว้เป็นเวลา 24 ชั่วโมงกับเซลล์ Caco-2
Genotoxicity ไม่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญในตัวอย่างการรักษาด้วย SHIME เมื่อเทียบกับการควบคุมสื่อเชิงลบ (ข้อมูลที่ไม่แสดง)
4. การอภิปราย
การเสียชีวิตและความเสี่ยงสูงต่อการเป็นมะเร็งลำไส้ใหญ่และโรคประจำตัวโดยเฉพาะอย่างยิ่งในอาหารจะเน้นถึงความจำเป็นในการระบุส่วนประกอบอาหารเพื่อลดความเสี่ยง [22]
Pre-biotics ซึ่งเป็น prebiotics ของ inulin-type โดยเฉพาะกำลังเกิดขึ้นเป็นส่วนประกอบของอาหารซึ่งสามารถส่งผลต่อองค์ประกอบของ microbiota ในลำไส้และการเผาผลาญอาหารได้ดีและแสดงให้เห็นถึงประโยชน์ของ biomarkers ของมะเร็งลำไส้ใหญ่ในการศึกษาในหลอดทดลองและในร่างกาย [6] .
การศึกษาเมื่อเร็ว ๆ นี้ยังเกี่ยวข้องกับการปลูกถ่ายอุจจาระเป็นวิธีการเปลี่ยน microbiota ในกระเพาะอาหารเพื่อประโยชน์ต่อสุขภาพอย่างไรก็ตามวิธีการวิจัยนี้อยู่ในช่วงวัยเด็กและโดยปกติจะใช้ได้กับบุคคลที่มีความเสี่ยงสูง [23]
ระบบวัฒนธรรมอย่างต่อเนื่องจำลองสภาพแวดล้อมของส่วนลำไส้ใหญ่ที่แตกต่างกันที่พบในร่างกายและสามารถเปลี่ยนแปลงเนื้อหาในช่องท้องระดับภูมิภาคได้ในลักษณะที่ไม่สามารถทำได้ในการศึกษาการแทรกแซงของมนุษย์ตามปกติ [10,16]
งานวิจัยหลายชิ้นได้ศึกษาความสัมพันธ์ระหว่าง DP กับการเปลี่ยนแปลงการหมักของ inulin แบบเส้นตรง [9,10] อย่างไรก็ตามข้อมูลเกี่ยวกับอิทธิพลของอินนูลินที่มีกิ่งก้านสาขาต่อองค์ประกอบและการหมักของจุลินทรีย์และประโยชน์ต่อสุขภาพ
ผลการศึกษาจากการศึกษาของเราได้แสดงให้เห็นว่าฟรุกโตแลน Agave ที่มีกิ่งก้านมีกิจกรรมสำคัญที่ทำให้เกิดการติดเชื้อแบคทีเรียชนิด bifidogenic ควบคู่ไปกับการผลิต SCFA ที่เพิ่มขึ้นอย่างมาก (โดยเฉพาะอย่างยิ่งไซยาไนด์) และการลดการผลิตแอมโมเนีย นอกจากนี้การเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของแบคทีเรียไบฟิโดแบคทีเรียได้รับการบันทึกไว้ใน PV จำลองและโทรทัศน์ของ SHIME และแม้ว่าจะมีการเพิ่มขึ้นของ DV แต่ก็ยังไม่ถึงความสำคัญ
ผลลัพธ์ที่ได้จากการศึกษาต่อเนื่อง cul-ture นี้ยืนยันผลกระตุ้นของ AGV ต่อประชากรของ bifidobacteria ควบคู่ไปกับการเพิ่มขึ้นของกรดไขมันแบบสั้นที่พบในการศึกษาการเพาะเลี้ยงแบบแบทช์โดย Gomez et al. [15]
อย่างไรก็ตามการเพิ่มขึ้นของประชากร lactobacilli ในการศึกษาของเราในเรือ SHIME ทั้งหมด 3 ครั้งไม่ได้มีนัยสำคัญทางสถิติซึ่งแตกต่างจาก Gomez et al. ศึกษา.
การศึกษาในปัจจุบันได้ให้ข้อมูลเพิ่มเติมเกี่ยวกับกิจกรรมการหมักตามลำไส้ใหญ่จำลอง การศึกษาก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นถึงการใช้ prebiotics อย่างสม่ำเสมอในการเลือกแบคทีเรียและแบคทีเรียชนิด bifidobacteria และ lactobacilli ที่มีการคัดเลือกเพิ่มขึ้นและแบคทีเรียเหล่านี้และกิจกรรมหมักของพวกเขาได้รับการเสนอว่าจะต้องรับผิดชอบในการปรับตัวของจุลินทรีย์ที่นำไปสู่ประโยชน์ต่อสุขภาพมากมาย [24]
การเพิ่มขึ้นของ pop-ulation ที่ระบุไว้ในกลุ่มเหล่านี้เมื่อได้รับการรักษาโดย AGV จะมีผลต่อ Agave เป็นอีกทางเลือกหนึ่งในการให้ prebiotics ของ inulin-type
อย่างไรก็ตามงานวิจัยเพิ่มเติมเพื่อตรวจสอบสายพันธุ์เฉพาะที่ได้รับประโยชน์จากการเสริม AGV และการใช้งานในอนาคตโดยใช้เทคโนโลยีการเกิด pyrosequencing อาจทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงที่สำคัญยิ่งขึ้นของ microbiota [25]
กรดไขมันเส้นสั้นเป็นผลิตภัณฑ์ที่สำคัญของการหมักแบบ prebiotic และความเข้มข้นของโคโลนีที่เพิ่มขึ้นของเหล่าสารประกอบปอนด์ (acetate, propionate และ butyrate) เป็นประโยชน์ต่อสุขภาพของอินนูลิน [26]
การศึกษานี้แสดงให้เห็นถึงการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของ SCFA โดยมีการเพิ่มสัดส่วนของบิวเทียในเรือทั้ง 3 ชนิดที่เพิ่มขึ้นอย่างเห็นได้ชัดทำให้มีการหมักแบบ saccha-rolytic ที่เพิ่มขึ้น
Butyrate เป็นสารที่มีความสำคัญในลำไส้ใหญ่โดยมีบทบาทหลายอย่างรวมถึงการให้ความต้องการในการเผาผลาญของอาณานิคม 70% โดยควบคุมการสร้างสมดุลของเยื่อบุผิวจากกระเพาะลำไส้ใหญ่ผ่านทางความสามารถในการขยายตัวและ apoptotic ในเนื้อเยื่อที่มีสุขภาพดีและเปลี่ยนไปตามลำดับ [27] (immunomodulatory activity) ผ่านกิจกรรมยับยั้ง histone deacetylase ในการแสดงออกของ NFkB [28]
ผลกระทบที่เกิดจากยาบ้าของ AGV เป็นข้อสังเกตที่พึงประสงค์และได้รับการแนะนำว่าเป็นผู้ให้ความสำคัญต่อประโยชน์ต่อสุขภาพของพรีไบโอติกต่อสุขภาพลำไส้ใหญ่ [29]
การทดลองก่อนหน้านี้ของ SHIME ที่ตรวจสอบกิจกรรม prebi-otic ของ inulin เชิงเส้นได้แสดงกิจกรรมที่คล้ายกัน [8]
การลดลงของแอมโมเนียที่กลับได้และมีนัยสำคัญควบคู่ไปกับการเพิ่ม SCFA ที่เห็นได้ชัดในเรือท้องทะเลอาจเป็นผลมาจากการหมักแบบ sac-charolytic ที่เพิ่มขึ้นโดยใช้ค่าการหมักโปรตีน

การลดการให้แอมโมเนียกับ colonocytes ตามการเสริม prebiotic เป็นผลมาจากการเพิ่มการสะสมแอมโมเนียโดยแบคทีเรียและการป้องกันผลกระทบของ butyrate ยังช่วยลดความเป็นพิษของแอมโมเนีย [30,31]
การลดแอมโมเนียที่สังเกตได้ควบคู่ไปกับการเพิ่มขึ้นของเชื้อแบคทีเรียและการผลิตกรดไขมันอิสระในระยะสั้นในระหว่างการรักษาด้วย AGV บ่งชี้ว่าระดับการเปลี่ยนจากการหมักโปรตีนไปเป็นกระบวนการหมักต่อเชื้อ saccharolytic มีความสำคัญเป็นอย่างยิ่งในเรือไกล่เกลี่ยที่ทำให้การหมักโปรตีนมีผลต่อการสะสมสารพิษ .

ฟังก์ชั่น Barrier ของเยื่อบุกระเพาะลำไส้ใหญ่มีความสำคัญต่อการรักษาสุขภาพและภูมิคุ้มกันของร่างกายมนุษย์ [32]
การสูญเสียการทำงานของอุปสรรคเป็นปัจจัยสำคัญในการสร้างความผิดปรกติเกี่ยวกับระบบทางเดินอาหารรวมถึงโรคลำไส้อักเสบและการส่งเสริมมะเร็งลำไส้ใหญ่ [33e35]
แม้ว่าจะมีกลไกหลายอย่างที่บ่งชี้ว่ามีบทบาทในการป้องกันมะเร็งลำไส้ใหญ่ แต่ก็ยังไม่สามารถอธิบายถึงผลกระทบทางพยาธิวิทยาที่แน่นอนของการซึมผ่านของระบบทางเดินอาหารที่เปลี่ยนแปลงไปในกระบวนการ carci-nogenesis [36,37]
Gill และคณะ แสดงให้เห็นถึงการใช้รูปแบบการทำงานของกั้นน้ำโกโก้ -2 ที่น้ำอุจจาระของผู้ใหญ่ที่มีสุขภาพดีช่วยเพิ่มประสิทธิภาพในการทำงานของอุปสรรคในขณะที่ผู้สูงอายุพิการได้แนะนำให้ใช้น้ำอุจจาระเป็นตัวบ่งชี้เพื่อยับยั้งการเปลี่ยนแปลงของอุปสรรคในการทำงานของอายุ [20]
รูปแบบ ex-vivo imilar ถูกนำมาใช้ในการตรวจสอบอิทธิพลของส่วนประกอบอาหารและสารอาหารที่มีต่อสิ่งกีดขวางเช่น pro biotics, prebiotics, butyrate และ vitamin D ซึ่งได้รับการปรับปรุงเพื่อปรับปรุงการทำงานของอุปสรรค [38e42]
การใช้โมเดล ex-vivo และ in-vivo เหล่านี้สามารถช่วยในการระบุชิ้นส่วนอาหารที่เปลี่ยนแปลงการทำงานของอุปสรรคเพื่อให้สามารถพัฒนากลยุทธ์ด้านโภชนาการเพื่อป้องกันการด้อยค่าของอุปสรรคเกี่ยวกับอายุและลดความเสี่ยงต่อโรคที่เกี่ยวข้องได้
การศึกษาแบบ Cur-rent ใช้แบบจำลอง Barrier ของ Caco-2 เพื่อตรวจสอบอิทธิพลของการหมักของ AGV
การศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าการหมักซุปเปอร์ AGV จากเรือ SHIME ทั้งหมดทำให้ความต้านทานต่อชั้นเดียวสูงขึ้นแม้ว่าจะมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญในลำไส้เล็กและลำไส้เล็กและผลลัพธ์เหล่านี้ได้รับการยืนยันจากผลของ fluorescein
ความซับซ้อนและความหลากหลายของสารที่อยู่ใน supernatants ของ SHIME ทำให้ยากที่จะสรุปได้ว่าสารประกอบที่เกี่ยวข้องกับ bioactivity ที่สังเกตได้
อย่างไรก็ตามกลไกที่เป็นไปได้ในการเพิ่มขีดความสามารถในการกั้นอุปสรรคคือความเข้มข้นของ SCFA ที่เพิ่มขึ้น (โดยเฉพาะอย่างยิ่งของไซยาไนด์) ที่เห็นได้จากการหมักซุปเปอร์ AGV [38,43e45]
Butyrate ถูกคิดว่าทำหน้าที่ผ่านการควบคุมโปรตีนที่แน่นหรือควบคุมการชุมนุมของพวกเขา ในทางตรงกันข้ามกับผลกระทบต่อการทำงานของอุปสรรคไม่มีผลต่อการป้องกันดีเอ็นเอ แต่อย่างใด biomarker มะเร็งอื่น ๆ ได้รับการทดสอบ
ผลประโยชน์ที่ได้รับจาก geno-toxicity ได้รับการรายงานสำหรับ prebiotic บางชนิดในสัตว์และมนุษย์ [45,46] และสำหรับผสมโปรไบโอติก / พรีไบโอติกในมนุษย์ [42] ที่มีความเข้มข้นของ SCFA เพิ่มขึ้นโดยเฉพาะอย่างยิ่งไซเทรียลที่เกี่ยวข้องกับฤทธิ์ต้านแอนติเจน [44] .
การศึกษานี้แสดงให้เห็นว่า AGV ได้กระตุ้นให้เกิดเชื้อ bifidobacteria ในรูปแบบลำไส้ของมนุษย์โดยไม่มีการเปลี่ยนแปลงจำนวนแบคทีเรียรวมทั้งการเพิ่มความเข้มข้นของ SCFA
ร่วมกับการแสดงให้เห็นถึงการเพิ่มประสิทธิภาพในการทำงานของอุปสรรคในหลอดทดลองผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นอย่างชัดเจนว่า AGV มีศักยภาพในการเป็น prebiotic ซึ่งจำเป็นต้องได้รับการยืนยันในการศึกษาการควบคุมการบริโภคอาหารด้วยยาหลอกที่ได้รับยาหลอก
โครงการนี้ได้รับการสนับสนุนทางการเงินจากกระทรวงการศึกษาและการเรียนรู้ Northern Ireland และรางวัลการให้รางวัลกองทุนรางวัลระดับ

ไม่มีความคิดเห็น:

แสดงความคิดเห็น