International Journal of Biological Macromolecules
In vitro assessment of agave fructans (Agave salmiana) as prebiotics and immune system activators
Abstract
The prebiotic effect of agave fructans (Agave salmiana) was evaluated through the growth of two lactic acid bacterial (LAB) strains (Lactobacillus casei
and Bifidobacterium lactis).
The immune system was acti-vated through the stimulation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of healthy subjects testing fructans, LAB or a mixture of these compounds at different concentrations.
Immune responses, such as early cell activation (CD69), cell cycle progression, nitric oxide (NO) production
and the expression of transcription factors for lymphocyte differentiation, were analyzed.
Compared with other fructans, the extracted agave fructans showed the highest prebiotic activity
and increased levels of CD69 expression,proliferative activity
and NO production when administered with the probiotic L. casei.
The Th1 lympho-cyte differentiation produced through LAB stimulation was greatly diminished after the incorporation of agave fructans.
In conclusion, these types of fructans (A. salmiana) are involved in the activation
and selective differentiation of cells of the immune system through interactions with probiotics.
Thus, agave fructans represent a novel immunomodulator that might benefit the functional food industry.
1. Introduction
Fructans, a heterogeneous mixture of fructose polymers linked by fructose–fructose glycosidic bonds [1], are increasingly being added to foodstuffs
and medical treatments with claims of health benefits [2,3].
In Mexico, fructans are isolated from the agaves, as the main photosynthetic product stored in the stem of these plants [4].
Due the structure
and type of link ( 2-1 and 2-6) of these molecules, fructans are considered as prebiotics [5].
Fruc-tans are not digestible through intestinal tract enzymes,
and whole molecules pass into the colon, where these polymers become fer-mented through beneficial intestinal microflora, also known as probiotics or lactic acid bacteria (LAB), favoring the growth of these microorganisms [6–9]. This activity induces many health benefits, such as reduced blood glucose levels
and increased lipid homeostasis, mineral availability
and modulation of immune func-tions [10–14].
Some studies on the immune system have reported the regulation of intestinal micbiota, increased resistance to infections,
and the reduced activity of gastrointestinal diseases,
allergic reactions and colon cancer cells [13,15–17].
Fructans have been associated with the immune system through the recognition of the molecular patterns of LAB in the intesti-nal microflora, which affects the composition of the gut-associated lymphoid tissue (GALT).
Intestinal epithelial cells detect peptido-glycan in Gram-positive bacteria through Toll-like receptor (TLR2)
and major histo-compatibility complex I and II molecules, result-ing in the activation of a complex intracellular signaling cascade,the up- or down-regulation of inflammatory genes
and the pro-duction of pro- or anti-inflammatory cytokines, initiating
and regulating both innate
and adaptive immune responses [13,18].
Bacterial signals can be transmitted to adjacent immune cells, such as macrophages, dendritic cells
and lymphocytes [15,18].
The main effect of probiotics is to increase the functions of innate immunity,including phagocytosis
and cellular cytotoxicity mediated through
natural killer cells (NK) [19,20],
and regulate the synthesis of cytokines inpolarized T-cells [21,22]. Due the regulatory T cellsplay a significant role in dampening misdirected immune responses,probiotics might exert anti-inflammatory effects through influenc-ing this T-cellpopulation[23].
T lymphocytes, Thelper lymphocytes CD4+ (Th)
and cytotoxic T lymphocytes CD8+ (CTL), are function-ally distinct cells depending on the type stimulation received from cytokines.
T helper cells can be subdivided into Th1, Th2, Th17
and regulatory T cells (Treg) through of the induction of spe-cific transcription factors, such as T-bet, GATA3, RORC
and FoxP3, respectively, to define an immune response [24]. Th1 cells medi-ate the cellular immune response through the production of the cytokines INF-
and TNF-· Th2 cells mediate the humoral immune response through the production of the cytokines IL-4 and IL-10.
Th17 cells are involved in the induction
and progression of sev-eral proinflammatory processes,
but the precise function of thesecells remains controversial.
Moreover, Treg cells regulate the activ-ity of other T cells upon completion of infectious or inflammatory processes [12,24].
The beneficial health effects attributed to the intake of prebi-otics have been reported in several in vivo
and in vitro studies [14,16,25–27].
However, little is known about the direct action of prebiotics with the immune system [15,28],
and particularly, there are no studies concerning the effects of agave fructans on immune cells.
Therefore, the aim of the present study was to evaluate the in vitro activity of agave fructans (Agave salmiana), as prebiotics
and immune system activators, on peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy subjects in the presence
and absence of LAB at different concentrations. The results of these studies using agave fructans were compared with those of other studies using the widely known
and distributed inulin-type fructans from chicory.
2. Materials and methods
2.1. Fructans and microorganisms
Extracted A. salmiana fructans, commercial chicory inulin-type fructans (Beneo Orafti® LGI, Tienen, Belgium)
and reagent chicory inulin-type fructans (Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, USA)
were used, and the specific characteristics of these compounds are listed in Table 1 [4,29,30]. Two lyophilized strains of lac-tic acid bacteria (LAB), Bifidobacterium lactis (SACCO BLC1, RAFF,Zapopan, Jal, Mexico)
and Lactobacillus casei (SACCO BGP93,RAFF, Zapopan, Jal, Mexico), were used. Lyophilized L. casei was reactivated in 20 mL of Man-Rogosa-Sharpe broth (MRSB;Becton-Dickinson Difco, San Jose, CA, USA) using a inoculation loop
and incubated at 37 ◦C for 24 h, while lyophilized B. lactis required two sequential reactivations of 24 h in MRSB supplemented with 0.5 g/L l-cysteine (Analytica, Monterey, NL, Mexico) under the same conditions.
To characterize the growth phases of both strains, a 24 h growth curve for each microorganism was performed in a 1-L flask of MRSB,
and samples were collected at different time periods (0.5–1 h intervals).Microbial growth was determined through plate counting using the Miles and Misra method [31].
The growth curves for both bacteria showed similar behavior, reaching the station-ary phase between 12 and 15 h.
Therefore, 24 h incubation was enough to achieve stable bacterial growth in subsequent assays.
For the immunological stimulation of cells, both bacterial strains were grown to the stationary phase, washed
and resuspended at 1 × 1010 CFU/mL (Log 10 CFU/mL) in sterile phosphate-buffered saline (PBS).
To evaluate the concentration of LAB, six sequential dilutions at 10% of this bacterial suspension were performed in PBS to obtain inocula at different concentrations (Log 8, Log 6 and Log 4 CFU/mL),
and the inocula were stored at 4 ◦C during the study.
The concentration and bacterial viability of each inoculum was verified through weekly plate counting, which remained constant for 45 days.
2.2. Assessment of the prebiotic activity of fructans The prebiotic effect of fructans was evaluated trough the B.
lactis and L. casei growth.
The response as prebiotic was evalu-ated using a culture media with the same composition of MRSB
but replacing the carbohydrate source for the fructan type (agavefructans, commercial inulin or reagent grade inulin).
This bacterial growth was also evaluated incommercial MRSB and inthe prepared MRSB without carbohydrate source (MRSB-WCH). These assays were used as controls. The prepared MRSB contains 10 g protease peptone No.3 (Becton-Dickinson Difco, SanJose, CA, USA), 10 gmeat extract (Becton-Dickinson Bexon, DF, Mexico), 5 g yeast extract(Becton-Dickinson), 1 g Tween 80 (Química Meyer, DF, Mexico), 2 gammonium citrate (Química Meyer), 5 g sodium acetate (Analytica,Monterrey, NL, Mexico), 2 g dipotassium hydrogen phosphate 2.0(Sigma–Aldrich, St. Louis, MO, USA)
and 0.1 g magnesium sulfate(CTR, Monterrey, NL, Mexico), diluted in a liter of distillate water.
The fructans concentration in all the assays was 20 g/L. All the broth culture media for B. lactis were supplemented with 0.05 g/Ll-cysteine.
The activated LAB was inoculated with 0.6% (v/v), cor-responding to approximately 1 × 108 CFU/mL in different culture media (25 mL)
and incubated for 24 h at 37 ◦C.
The precise con-centration of each inoculum was verified through plate counting.
Samples were collected from each assay
and plated onto MRS agar using the Miles
and Misra method [31], and the bacteria were incu-bated anaerobically at 37 ◦C for 48 h. The growth ofthe bacteria was quantified through plate counting
and expressed as Log CFU/mL.
All assays were performed in triplicate yielding a total of 30 exper-iments.
2.3. In vitro immune stimulation of PBMC using two microorganisms
and two fructans 2.3.1.
Cell culture
Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were isolated using the Ficoll-Hypaque (Sigma–Aldrich) technique, washed
and cul-tured at a density of 1 × 106 cells/mL at 37 ◦C and 5% CO2 in 12-well
plates (Corning Costar, Corning, NY, USA) containing RPMI 1640 culture medium (GIBCO, Grand Island, NY, USA) supplemented with 10% fetal bovine serum (HyClone Laboratories, Logan, Utah,USA)
and 2 mol/L l-glutamine (Sigma–Aldrich) without antibi-otics.
The PBMC were stimulated with agave fructans (extracted from A. salmiana), chicory inulin-type fructans (Sigma–Aldrich), L.casei, B. lactis or different mixtures of fructans/LAB at the indicated concentrations according to the experimental design.
2.3.2. Early cell activation Early cell activation was measured through the expression of CD69 by flow cytometry analysis. After 24 h of incubation,cultivated PBMC were immunostained with mouse anti-human CD69-phycoeritrin (PE)-labeled monoclonal antibody (Becton-
Dickinson, Bioscience, San Jose, CA, USA), washed with PBS, fixed with 1% p-formaldehyde,
and analyzed using a FACSCalibur flow cytometer with Cell Quest software (Becton Dickinson).
The results are expressed as the percentage of positive cells.
PBMC stimulated with phorbol myristate acetate (PMA; 20 ng/mL; Sigma–Aldrich) were used as a positive control for this technique.
2.3.3. Cell proliferation or cell cycle
The cell cycle of the treated cells was determined accord-ing to the nuclear DNA content through flow cytometry.
After 72 h of incubation, cultivated PBMC were washed with PBS
and resuspended with vigorous stirring in a hypotonic fluoro-chrome solution (propidium iodide in sodium citrate, plus 0.1% Triton X-100).
The samples were incubated at 4 ◦C in the dark for 30 min prior to the flow cytometry analysis. The results were expressed as the percentage of cells in distinct phases of the cell cycle: G0/G1 (normal diploid DNA phase), S (DNA synthesis phase), and G2/M (mitosis phase).
PBMC stimulated with phytohemagglutinin (PHA;10 g/mL; Sigma–Aldrich) were used as a positive control for this technique [32].
2.3.4. Nitrite concentration
The nitric oxide (NO) production in cells was estimated through the measurement of nitrite (NO2−) using a microplate assay based on the Griess reaction. 100 L of supernatant aliquots of each assay were incubated with 10 L of Griess A reagent [0.1%, w/v N-(1-naphtyl)-ethylenediamine hydrochloride (NEDD)]
and 10 L of Griess B reagent (2%, w/v sulfanilamide in 5% HCl) at room tem-perature for 20 min. The absorbance at 540 nm was determined on a Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader (Biotek, Winooski,VT, USA).
NO2− was determined through calibration curve using sodium nitrite as a standard at concentrations from 0 to 200 mM.
PBMC stimulated with lipopolysaccharide (LPS; 5 g/mL; E. coli;
Sigma–Aldrich) were used as a positive control for this technique[33].
2.3.5. Experimental design A distance-based experimental design was performed to obtain the principal effects of 2 categorical variables (LAB and fructans type), 2 continued variables [LAB concentration (CLAB)
and fructans concentration (Cfructans)],
and the first order interactions between them. Six blocks were selected to eliminate the unwanted effect of interindividual variability, yielding a total of 30 experiments as shown in Table 2. The response variables included the early activation of lymphocytes (percentage of CD69 positive cells), the proliferation in cell cycle (S or G2/M) and NO production.
2.4. Transcription factors expression in lymphocyte differentiation of stimulated PBMC
TotalRNA was isolatedfrom2millionPBMCusing TRIzol reagent
(Invitrogen, Life Technology, Carlsbad, CA, USA),
and the concen-trations
and integrity of the RNA sample were measured using a spectrophotometer Synergy HT (Biotek). cDNA was generated with 100 ng of total RNA using the High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, Foster, CA, USA) accord-ing to the manufacturer’s instructions. A total of 100 ng of cDNA was applied to real-time PCR using predesigned TaqMan gene expression assays, according to the manufacturer’s instructions (Applied Biosystems).
The following probes were used: TBX21,Hs00203436/m1; GATA3, Hs00231122/m1; RORC, Hs01076112/ml;and FOXP3, Hs01085834/m1.
The mRNA levels were normalized to 18S as an endogenous control.
All reactions were analyzed using a 7900HT CFX96 Real-Time PCR System (BioRad, Hercules, CA, USA).
The cycle threshold (Ct) values, corresponding to the PCR cycle number at which the fluorescence emission reaches a threshold above baseline emission, were determined for the basal expression of mRNA.
The relative mRNA expression was calculated using the 2−Ct method for the mitogen-induced expression of mRNA in relation to unstimulated cells [34].
2.5. Statistical analysis
The statistical analysis was performed using the Design Expert 7 (Stat-Ease, Minneapolis, MN, USA) statistical package.
The results are reported as the means ± standard error (SE)for parametric data.
Analysis of variance (ANOVA)
and comparison of the means were conducted using Tukey’s test.
A probability value of p < 0.05 was considered significant.
3. Results and discussion
3.1. Assessment of the prebiotic activity of fructans The principal characteristic of prebiotics is the ability to enhance the proliferation of beneficial microbes or probiotics in human colonic microbiota [10]. In the present study, we analyzed the prebiotic activity of the extracted A. salmiana fructans (Fructan A.s) compared with that of conventional prebiotics preparations.
The results were expressed as growth of LAB (L. casei and B. lac-tis)
and are showed in Fig. 1. The results were calculated as the difference in CFU/mL between the strain growth
and the inoc-ulated quantity (CFU/mL); thus, the height of the bar indicates the net growth after 24 h, expressed in Log CFU/ml ranging from 8.1 to 9.3 Log CFU/mL. In all the fructans tested, enhanced bacte-rial growth (p < 0.05) with respect to the negative control (culture media with the same composition of commercial MRSB but with-out a carbohydrate source; MRSB-WCH) was observed. For L. casei,there were no statistically significant differences between either the tested fructans or the positive control, but all bacterial growth ranged from 9.07 to 9.2 Log CFU/mL compared with the standard commercial media MRSB, indicating high prebiotic activity.
How-ever, for B. lactis, the type of fructans might be an important factor (p < 0.05), as the agave fructans showed the highest bacte-rial growth (8.8 ± 0.4 Log CFU/mL)
and consequently the highest prebiotic activity.
Differences in bacterial growth due to the strain type were observed, where L. casei constantly showed higher growth than B.lactis (p < 0.05). These results were consistent with other reports confirming differences between L. casei and B. lactis growth using saccharides [35]. Differences in the ability of each strain to use dis-tinct prebiotic preparations might reflect the wide phylogenetic
differences between L. casei
and B. lactis, as these bacteria belong
Fig. 1. Prebiotic activity of agave fructans.
The prebiotic effect of extracted Agave
salmiana fructans (Fructan A.s), commercial chicory inulin-type fructans (inulin
commercial) and reagent chicory inulin-type fructans (inulin reactive) was eval-uated through the growth of two strains of LAB
and compared with two standard controls, commercial MRSB and MRSB without carbohydrate source (MRS-WCH).
The growth of the bacteria was expressed as Log CFU/mL. All assays were performed
in triplicate, yielding a total of 30 experiments.
The values are the means ± S.E.
Data with different superscript letters are significantly different at p < 0.05 according to the t-test.
to different phyla (Firmicutes and Actinobacteria, respectively) [18].
There was also an interaction between fructans type and the strain
used (p < 0.05), where all the fructans tested were more selective
to the type of strain, favoring L. casei. In addition, it was described
that prebiotics might selectively stimulate the growth and activity
of one or more bacterial numbers [10]. Therefore, agave fructans
might promote L. casei growth more than B. lactis.
Others in vivo studies have reported bacterial strain dependence in the presence of fructo-oligosaccharides [35].
In addition, it has been reported
that lower degree of polymerization (DP) fructans more efficiently support the growth of B. lactis than high DP substrates [36].
These data suggest that the agave fructans induce LAB growth same
or better than commercial fructans.
3.2. In vitro activation of PBMC using two microorganisms and two fructans
Because a fundamental immunomodulatory role of the pro-biotics
and prebiotics on cells and immune responses has been previously demonstrated [13,25], in this study was investigated whether agave fructans activate the immune system
and induce cell proliferation.
Table 3 shows the significant effect of differentfactors , such as CLAB (A), CFructans (B), LAB type (C), fructans type (D)
and the interactions between them, on each response vari-able.
The early activation of the lymphocyte population in response to stimuli (fructans and LAB) was measured as the percentage of CD69-positive cells.
Lymphocyte activation depends on CLAB (A),
the fructans type (D) tested, the interactions between the LAB strain
and fructans type (C × D) and their respective concentrations(A × B).
The C × D interaction is shown in Fig. 2a for different fruc-tans/LAB combinations.
The agave fructans/L. casei mixture (F + L) showed increased activation, with 10.8% of CD69-positive cells.
Fig. 2b shows the response to the A × B interaction for the F + L mix-ture, where the activation increased with higher CFructans
and lower CLAB, with 12.4% of CD69+ of lymphocytes.
These results are consis-tent with previous studies showing increased CD69 expression in CD8+NK
and CD8+T cells after stimulation with Lactobacillus strains [37].
In addition, other studies have shown a significant increase of CD4+CD25+ (T-helper activated regulatory cells), CD8+CD25+ (T-suppressor/cytotoxic activated cells),
and CD16+CD56+ (NK cells) upon stimulation with probiotics strains [38].
These data sug-gest that the F + L mixture shows immunomodulatory effects on immune cells.
However, we assessed the effect of fructans on the PBMC cell cycle.
Fig. 3a describes a typical DNA histogram, showing three cell populations (G0/G1, S and G2/M) based on the DNA content.
From these phases, only the S phase was significantly affected (p < 0.05)
in response to the CLAB (A), LAB type (C)
and the interactions A × B,B × C
and B × D, while with the type
and concentration of fruc-tans (B and D) showed no effects.
Nuclear DNA replication occurs in the S phase, indicating PBMC proliferation, which was induced predominantly through LAB in a dose–response manner. The cell
percentage in the S phase from PBMC assays stimulated with LAB
and fructans mixtures is represented in Fig. 3b, where agave fruc-tans/L. casei mixture (F + L) showed the highest percentage at 11.9%, which was greater than that shown for the positive control (PHA)(p > 0.05).
In vivo studies have described the increased proliferation
and activity of CD56+ NK cells in peripheral circulation after the consumption of LAB strains in elderly subjects [20],
and induced murine splenocyte proliferation was observed in rats after LAB con-sumption [39]. Furthermore, it was reported that Bifidobacterium longum was effective for induction of IgA+ cells proliferation in small
and large intestine of mice during infection [40].
The results obtained in the present study showed that the fructans/L. casei mixture induced the proliferation of immune cells.
Moreover, we measured nitric oxide (NO) synthesis to deter-mine whether agave fructans induced monocyte activity. The nitrite concentration in the supernatant was determined as an indi-rect measure of the synthesis of NO, a mediator of many immune
and inflammatory responses, produced exclusively from mono-cytes/macrophages.
Table 3 shows that the CLAB (A)
and type of LAB (C) are the principal factors that positively affect NO production.
Fig. 4 shows the C × D interaction, for nitrite concentration at 24
and 72 h of stimulated PBMC.
The greatest production was observed at 72 h of incubation in all cases,
and the agave fructans/L. casei
Fig. 2.
Effect of agave fructans on the early activation of lymphocytes.
CD69 expression was evaluated in PBMC of healthy subjects using flow cytometry.
PBMC were isolated as indicated in Section 2
and stimulated for 24 h with agave fructans (extracted from Agave salmiana), chicory inulin-type fructans (reagent from Sigma–Aldrich), L. casei,B. lactis
and different mixtures of fructans/LAB at concentrations according to the experimental design. PBMC stimulated with 20 ng/mL of phorbol myristate acetate (PMA) were used as a positive control. (a) C × D factors interaction (p < 0.05), concentrations of CLAB: 4 Log CFU/mL
and Cfructan: 0.5 mg/mL. The values are the means ± LSD of the distance-based experimental design.
I + L: inulin plus L. casei; I + B: Inulin plus B. lactis; F + L: agave fructan plus L. casei; F + B: agave fructan plus B. lactis. (b) Response of A × B factors interaction (p < 0.05) for the L. casei
and agave fructans mixtures. *p < 0.05 versus positive control PMA.
Fig. 3.
Effect of agave fructans on cell cycle progression.
The cell cycle was determined for nuclear DNA content using flow cytometry.
PBMC were isolated as indicated
in Section 2 and stimulated for 72 h with agave fructans (extracted from Agave salmiana), chicory inulin-type fructans (reagent from Sigma–Aldrich), L. casei, B. lactis
and different mixtures of fructans/LAB at concentrations according to the experimental design. The results are expressed as the percentage of cells in distinct phases of the cell cycle: G0/G1 (normal diploid DNA phase), S- (DNA synthesis phase),
and G2/M (mitosis phase).
PBMC stimulated with 10 g/mL of phytohemagglutinin (PHA) were used as a positive control. (a) Cytometer histogram, (b) Cell percentage of synthesis phase, C × D factors interaction (p < 0.05), at concentrations of CLAB: 8 Log CFU/mL and Cfructans:1 mg/mL.
The values are the means ± LSD of the distance-based experimental design. I + L: inulin plus L. casei; I + B: inulin plus B. lactis; F + L: agave fructans plus L. casei; F + B:agave fructans plus B. lactis. *p < 0.05 versus positive control PHA. mixture (F + L) showed the highest NO production in monocytes,with 11.5
and 18.3 М NO2 for 24 and 72 h respectively.
These results were greater than those obtained for the positive control (LPS) (p > 0.05). Reactive nitrogen intermediates might be involved in the regulation of monocyte function, showing immunoregu-latory effects relevant to the control of infection as part of a mechanism to mediate macrophage cytotoxicity against different infectious agents [41].
The increased CD69 expression, cell prolif-eration
and NO production were observed with the probiotic L. casei and the prebiotic agave fructans.
These results suggest that the agave fructans/L. casei mixture might have immunomodulatory effects on T lymphocytes, as monocytes/macrophages play a cen-tral role in immune regulation through the presentation of antigen to T lymphocytes [42,43].
Notably, a direct interaction between immune system cells
and fructans was demonstrated, as the highest expression of CD69 on lymphocytes of stimulated PBMC was observed only in the presence of agave fructans,
and the effect was even greater than that presented by PBMC stimulated with either LAB alone or fructans/LAB (Fig. 2a).
The activated cells interacted with other immune-component cells
and might induce different immune sig-nals and responses.
3.3. Transcription factor expression in lymphocyte differentiation of stimulated PBMC Previous reports indicate that prebiotics/probiotics induce a shift in the type of T helper immune response against some anti-gens [44,45].
Therefore, the relative expression of lymphocyte evaluated.
Fig. 5.
Effect of agave fructans on the expression of transcription factors in lymphocytes.
mRNA expression levels were evaluated in PBMC from healthy subjects using real-time PCR.
PBMC were isolated as indicated in Section 2
and stimulated with agave fructans (extracted from Agave salmiana), chicory inulin-type fructans (reagent from Sigma-Aldrich), L. casei, B. lactis
and different mixtures of fructans/LAB at concentrations according to the experimental design. (a) LAB strains, (b) fructans type, (c) mixtures at concentrations of CLAB: 8 Log CFU/mL
and Cfructans: 1 mg/mL.
The relative mRNA expression was calculated using the 2−Ct method.
I + L: inulin plus L. casei; I + B: inulin plus B. lactis; F + L: agave fructans plus L. casei; F + B: agave fructans plus B. lactis.
Assays without replicate for statistical analysis.
fructans (chicory inulin and agave fructans) showed the increased expression of Tbet
and FOXP3 transcription factors (Fig. 5b).
These results suggest that prebiotics directly or indirectly stimulate intestinal host defenses to produce a balanced T helper cell response
and prevent an imbalance that contributes to manifesta-tion of clinical disease [47]. However, additional studies are needed to show that prebiotics might directly induce the polarization of T helper responses.
Interestingly, an interaction between probiotic
and prebiotic stimuli was observed (Fig. 5c).
The differentiation induced through L. casei was greatly diminished, specifically for Tbet (Th1 response),when combined with agave fructans compared with L. casei alone.
In addition, B. lactis inducedGATA3 expression (Th2 response) when combined with agave fructans compared with B. lactis alone (Fig. 5a and c).
Notably, this phenomenon was not induced using inulin mixtures (Fig. 5a and c), as this compound did not specifically induce Th1 or Th2 cells (Tbet and GATA3 respectively).
These results suggest that agave fructans might specifically modulate the shift of T helper cells, depending on the LAB strain used.
Thus, agave fruc-tans should be used as a dietary product, as this compound might stimulate the adaptive immune response in a Th1 or Th2 direc-tion.
The induction of Th1 responses might prevent Th2-related immune disorders, such as allergies [44,45]
and the induction of Th2 responses to prevent or treat Th1 immune disorders, such as inflammatory bowel disease (IBD). Moreover, the induction of Th1 cells might treat the age-related decline in lymphoid cell activity 4. Conclusions
This study is the first investigation of the in vitro effect of agave fructans on the immune system.
Agave fructans showed a prebi-otic effect comparable to that of inulin-type fructans, which have been widely distributed for foodstuffs
and are involved in the acti-vation
and selective differentiation of cells of the immune system through interactions with probiotics.
These results are promising for the agave fructans extracted from A. salmiana.
Further in vitro and in vivo studies are needed to complement these results
and enhance our understanding of the direct or indirect effect of these compounds on the immune system, resulting in the controlled
and proper application of fructans in the development of functional products.
Acknowledgments
This work was supported through grants from CONACYT
(162350, 173965 and 169793) and UASLP (C12-FAI-03-58-58),
Mexico. MVL received a scholarship from CONACYT, Mexico.
References
[1] M. Wack, W. Blaschek, Carbohydr. Res. 341 (2006) 1147–1153.
[2] P. Kip, D. Meyer, R.H. Jellema, Int. Dairy. J. 16 (2006) 1098–1103.
[3] T.R. Klaenhammer, M. Kleerebezem, M. Volkmar Kopp, M. Rescigno, Nat. Rev.
Immunol. 12 (2012) 728–734.
วารสารนานาชาติทางชีววิทยาโมเลกุลเล็ก
การประเมินในหลอดทดลองของ agave fructans (Agave salmiana) เป็นตัวทำ Prebiotic และตัวกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกัน
นามธรรม
ผลของ prebiotic ของ agave fructans (Agave salmiana) ได้รับการประเมินโดยการเจริญเติบโตของสายพันธุ์แบคทีเรียแลคติค 2 สาย (LAB) (Lactobacillus casei
และ Bifidobacterium lactis)
ระบบภูมิคุ้มกันได้รับการกระตุ้นโดยการกระตุ้นเซลล์ไตโมโนนิวเคลียร์เลือดจากภายนอก (PBMC) ของคนที่มีสุขภาพดีในการทดสอบ fructans, LAB หรือส่วนผสมของสารเหล่านี้ในความเข้มข้นที่แตกต่างกัน
การตอบสนองต่อระบบภูมิคุ้มกันเช่นการกระตุ้นเซลล์ต้น (CD69) ความก้าวหน้าของวงจรเซลล์การผลิตไนตริกออกไซด์ (NO)
และการแสดงออกของปัจจัยการถอดความสำหรับความแตกต่างของ lymphocyte ได้รับการวิเคราะห์
เมื่อเทียบกับฟรุกโตสชนิดอื่นฟรุกโตสที่สกัดได้มีกิจกรรม prebiotic สูงสุด
และระดับที่เพิ่มขึ้นของการแสดงออก CD69, กิจกรรมการขยายตัว
และไม่มีการผลิตเมื่อทำกับ probiotic L. casei
ความแตกต่างของ lympho-cyte Th1 ที่เกิดจากการกระตุ้นด้วย LAB ลดลงอย่างมากหลังจากการผสมผสานของ agave fructans
สรุปได้ว่า fructans ชนิดนี้ (A. salmiana) มีส่วนเกี่ยวข้องในการกระตุ้น
และความแตกต่างของเซลล์ของระบบภูมิคุ้มกันโดยการปฏิสัมพันธ์กับโปรไบโอติก
ดังนั้น agave fructans แสดง immunomodulator ใหม่ที่อาจเป็นประโยชน์ต่ออุตสาหกรรมอาหารที่ทำงานได้
1. บทนำ
ฟรุกโตส - ฟรักโทส glycosidic พันธบัตร [1] ฟรักโทสที่เพิ่มขึ้นเป็นส่วนผสมในอาหาร
และการรักษาทางการแพทย์ที่มีสิทธิประโยชน์ด้านสุขภาพ [2,3]
ในเม็กซิโก fructans ถูกแยกออกจาก agaves เป็นผลิตภัณฑ์สังเคราะห์หลักที่เก็บไว้ในลำต้นของพืชเหล่านี้ [4]
เนื่องจากโครงสร้าง
และประเภทของการเชื่อมโยง (2-1 และ 2-6) ของโมเลกุลเหล่านี้ fructans ถือว่าเป็น prebiotics [5]
Fruc-tans ไม่ย่อยผ่านลำไส้เอนไซม์,
และโมเลกุลทั้งหมดจะผ่านเข้าสู่ลำไส้ใหญ่ซึ่งโพลิเมอร์เหล่านี้กลายเป็น fer-mented ผ่านจุลินทรีย์ในลำไส้ที่เป็นที่รู้จักกันว่าโปรไบโอติกหรือแบคทีเรียกรดแลคติก (LAB) ซึ่งเป็นที่นิยมในการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์เหล่านี้ [6-9] กิจกรรมนี้ก่อให้เกิดประโยชน์ต่อสุขภาพมากมายเช่นระดับน้ำตาลในเลือดลดลง
และการเพิ่มขึ้นของไขมันภายในบ้านความพร้อมของแร่
และการปรับการทำงานของระบบภูมิคุ้มกัน [10-14]
การศึกษาบางส่วนเกี่ยวกับระบบภูมิคุ้มกันมีรายงานการควบคุมของ micbiota ลำไส้เพิ่มความต้านทานต่อการติดเชื้อ,
และกิจกรรมลดลงของโรคระบบทางเดินอาหาร,
ปฏิกิริยาภูมิแพ้และเซลล์มะเร็งลำไส้ใหญ่ [13,15-17]
Fructans ได้รับการเชื่อมโยงกับระบบภูมิคุ้มกันโดยการรับรู้รูปแบบโมเลกุลของ LAB ในจุลินทรีย์ในลำไส้เล็กซึ่งมีผลต่อองค์ประกอบของเนื้อเยื่อน้ำเหลืองที่มีไทรอยด์ (GALT)
เซลล์เยื่อบุผิวในกระเพาะลำไส้จะตรวจจับ peptido-glycan ในแบคทีเรียแกรมบวกผ่าน Toll-like receptor (TLR2)
และโมเลกุล I และ II ความเข้ากันได้ของ histo-complex ซึ่งเป็นผลให้เกิดการกระตุ้นของน้ำตกที่มีสัญญาณภายในเซลล์ซับซ้อนขึ้นหรือลงไปตามระเบียบของยีนที่อักเสบ
และ pro-duction ของโปร - หรือต้านการอักเสบ cytokines เริ่มต้น
และควบคุมทั้งโดยธรรมชาติ
และการตอบสนองภูมิคุ้มกันปรับตัว [13,18]
สัญญาณแบคทีเรียสามารถส่งไปยังเซลล์ภูมิคุ้มกันที่อยู่ติดกันเช่น macrophages เซลล์ dendritic
และ lymphocytes [15,18]
ผลกระทบหลักของโปรไบโอติกคือการเพิ่มฟังก์ชั่นของระบบภูมิคุ้มกันตามธรรมชาติรวมถึง phagocytosis
และเซลล์ cytotoxicity mediated ผ่าน
เซลล์นักฆ่าตามธรรมชาติ (NK) [19,20],
และควบคุมการสังเคราะห์เซลล์ T-cytarines ในโพลาไรเซชัน [21,22] เนื่องจากกฎข้อบังคับของ T cellplay มีบทบาทสำคัญในการลดการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันที่ผิดพลาดโปรไบโอติกอาจมีฤทธิ์ต้านการอักเสบโดยมีอิทธิพลต่อการแพร่กระจาย T-cellpopulation นี้ [23]
lymphocytes T lymphocytes Thelper CD4 + (Th)
และ cytotoxic T lymphocytes CD8 + (CTL) เป็นเซลล์ที่แตกต่างกันในกลุ่มที่ทำงานโดยขึ้นอยู่กับการกระตุ้นของชนิดที่ได้รับจาก cytokines
เซลล์ T helper สามารถแบ่งออกเป็น Th1, Th2, Th17
และกฎระเบียบ T เซลล์ (Treg) ผ่านการเหนี่ยวนำของ spe - cific ปัจจัยการถอดรหัสเช่น T - bet, GATA3, RORC
และ FoxP3 ตามลำดับเพื่อกำหนดการตอบสนองภูมิคุ้มกัน [24] เซลล์ Th1 ทำหน้าที่ตอบสนองต่อระบบภูมิคุ้มกันของเซลล์โดยการผลิต cytokines INF-
และ TNF- ·เซลล์ Th2 เป็นสื่อกลางในการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่น่าพอใจโดยการผลิต cytokines IL-4 และ IL-10
เซลล์ Th17 มีส่วนร่วมในการเหนี่ยวนำ
และความคืบหน้าของกระบวนการ pro-inflammative เจ็ด -
แต่ฟังก์ชันที่แม่นยำของ thesecells ยังคงเป็นที่ถกเถียงอยู่
นอกจากนี้เซลล์ Treg จะควบคุมการทำงานของเซลล์ T อื่นเมื่อเสร็จสิ้นกระบวนการติดเชื้อหรืออักเสบ [12,24]
ผลกระทบต่อสุขภาพที่เป็นประโยชน์จากการรับ prebi otics ได้รับการรายงานในหลายรูปแบบ in vivo
และในหลอดทดลอง [14,16,25-27]
อย่างไรก็ตามยังไม่ค่อยมีใครรู้เกี่ยวกับการใช้ prebiotic กับระบบภูมิคุ้มกันโดยตรง [15,28]
และโดยเฉพาะอย่างยิ่งไม่มีการศึกษาเกี่ยวกับผลกระทบของ agave fructans ในเซลล์ภูมิคุ้มกัน
ดังนั้นวัตถุประสงค์ของการศึกษาในครั้งนี้คือการประเมินกิจกรรมในหลอดทดลองของ agave fructans (Agave salmiana) ในฐานะ prebiotics
และตัวกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันต่อเซลล์เม็ดเลือดขาวในหลอดเลือด (PBMC) จากคนที่มีสุขภาพดีในที่ที่มี
และไม่มี LAB ที่ความเข้มข้นต่างกัน ผลของการศึกษาเหล่านี้โดยใช้ agave fructans ถูกนำมาเปรียบเทียบกับผลการศึกษาอื่น ๆ
และกระจาย fructans อินนูลินชนิดจากสีน้ำเงิน
2. วัสดุและวิธีการ
2.1 Fructans และจุลินทรีย์
สารสกัดจาก A. salmiana fructans, fructans ชนิดอินติลินที่มีรสเปรี้ยวในเชิงพาณิชย์ (Beneo Orafti® LGI, Tienen, Belgium)
และตัวทำละลายชนิดอินติลินชนิดซิออรีน (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)
ถูกนำมาใช้และลักษณะเฉพาะของสารเหล่านี้แสดงไว้ในตารางที่ 1 [4,29,30] เชื้อแบคทีเรีย lac-tic (ไลบรารี) Loph (LAB) 2 สายพันธุ์ ได้แก่ Bifidobacterium lactis (SACCO BLC1, RAFF, Zapopan, Jal, Mexico)
และ Lactobacillus casei (SACCO BGP93, RAFF, Zapopan, Jal, Mexico) ถูกนำมาใช้ ไลโปไลซ์แอลเคซีถูกใช้งานได้ในน้ำซุป Man-Rogosa-Sharpe ขนาด 20 มล. (MRSB; Becton-Dickinson Difco ซานโฮเซ่แคลิฟอร์เนียสหรัฐอเมริกา) โดยใช้วิธีการฉีดวัคซีน
และบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมงในขณะที่ B. lactis ที่ถูกทำให้แห้งต้องมีการตอบสนองต่อเนื่องเป็นเวลา 24 ชั่วโมงใน MRSB เสริมด้วย l-cysteine 0.5 กรัมต่อลิตรภายใต้สภาวะเดียวกัน
เพื่อศึกษาลักษณะการเจริญเติบโตของสายพันธุ์ทั้งสองสายพันธุ์การเจริญเติบโตตลอด 24 ชั่วโมงของจุลินทรีย์แต่ละชนิดได้ดำเนินการในขวด MRSB 1 ลิตร,
และเก็บตัวอย่างในช่วงเวลาต่างกัน (ช่วง 0.5-1 ชั่วโมง) การเจริญเติบโตของเชื้อจุลินทรีย์โดยวิธีมิลส์และมิสรา [31]
เส้นโค้งการเจริญเติบโตของแบคทีเรียทั้งสองมีพฤติกรรมคล้ายคลึงกันซึ่งถึงระยะสถานีระหว่าง 12 ถึง 15 ชั่วโมง
ดังนั้นการบ่มเพาะ 24 ชั่วโมงก็เพียงพอที่จะทำให้แบคทีเรียมีเสถียรภาพเจริญเติบโตได้ในการตรวจวิเคราะห์ที่ตามมา
สำหรับการกระตุ้นทางภูมิคุ้มกันของเซลล์ทั้งสองสายพันธุ์ของเชื้อแบคทีเรียได้รับการปลูกให้อยู่ในรูปนิ่ง
และหมักที่อุณหภูมิ 1 × 1010 CFU / mL (log 10 CFU / mL) ในน้ำเกลือที่ปราศจากฟอสเฟตที่ปราศจากเชื้อ (PBS)
ในการประเมินความเข้มข้นของ LAB พบว่าใน PBS มีการเจือจางของซีลีเนียมที่หกที่ 10% ของเชื้อแบคทีเรียนี้เพื่อให้ได้รับ inocula ที่ความเข้มข้นต่างกัน (Log 8, Log 6 และ Log 4 CFU / mL)
และ inocula ถูกเก็บไว้ที่ 4 ◦Cในระหว่างการศึกษา
ความเข้มข้นและความทนทานต่อแบคทีเรียของเชื้อแต่ละชนิดได้รับการยืนยันโดยการนับจานวนสัปดาห์ซึ่งยังคงมีค่าคงที่เป็นเวลา 45 วัน
2.2 การประเมินผลกิจกรรม prebiotic ของ fructans ผล prebiotic ของ fructans ถูกประเมินผ่าน B.
lactis และการเจริญเติบโตของ L. casei
การตอบสนองเป็น prebiotic ถูกประเมินโดยใช้สื่อวัฒนธรรมที่มีองค์ประกอบเดียวกันของ MRSB
(agavefructans, inulin เชิงพาณิชย์หรืออินนูลินเกรดเอเจนต์)
การเติบโตของเชื้อแบคทีเรียนี้ยังได้รับการประเมิน MRSB แบบไม่ใช้แล้วและ MRSB ที่เตรียมโดยไม่มีแหล่งคาร์โบไฮเดรต (MRSB-WCH) การตรวจเหล่านี้ถูกใช้เป็นตัวควบคุม (Becton-Dickinson Bexon, DF, Mexico), สารสกัดจากยีสต์ 5 กรัม (Becton-Dickinson), 1 กรัม (Becton-Dickinson Difco, SanJose, CA, USA) Tween 80 (Química Meyer, DF, Mexico), 2 gammonium citrate (Química Meyer), 5 กรัมโซเดียมอะซิเตท (Analytica, Monterrey, NL, Mexico), 2 g dipotassium hydrogen phosphate 2.0 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, สหรัฐอเมริกา)
และแมกนีเซียมซัลเฟต 0.1 กรัม (CTR, Monterrey, NL, Mexico) เจือจางในลิตรของน้ำกลั่น
ความเข้มข้นของฟรุคโตสในการตรวจทั้งหมด 20 กรัม / ลิตร อาหารเลี้ยงเชื้อทุกชนิดสำหรับ B. lactis ถูกเสริมด้วย 0.05 g / Ll-cysteine
LAB ที่ถูกกระตุ้นด้วยเชื้อ 0.6% (v / v) cor ตอบสนองต่อปริมาตรการเพาะเลี้ยงที่แตกต่างกัน (25 มล.) ประมาณ 1 × 108 CFU / mL
และบ่มนาน 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส
การวัดความเข้มข้นของเชื้อแต่ละตัวได้รับการยืนยันโดยการนับจาน
เก็บตัวอย่างจากการตรวจวิเคราะห์แต่ละครั้ง
และชุบลงบน MRS MRS โดยใช้ไมล์
และวิธี Misra [31] และเชื้อแบคทีเรียถูกนำไปสังเคราะห์ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 48 ชั่วโมง การเจริญเติบโตของเชื้อแบคทีเรียถูกวัดปริมาณโดยการนับจาน
และแสดงเป็น Log CFU / mL
การทดสอบทั้งหมดทำในสามเท่าของผลผลิตทั้งหมด 30 ตัวอย่าง
2.3 การกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันของ PBMC ในหลอดทดลองโดยใช้จุลินทรีย์สองชนิด
และ fructans สองชนิด 2.3.1.
การเพาะเลี้ยงเซลล์
เซลล์เพาะเลี้ยงเซลล์เดียวในเลือด (PBMC) ถูกแยกได้โดยใช้เทคนิค Ficoll-Hypaque (Sigma-Aldrich)
และ cul-tured ที่ความหนาแน่นของ 1 × 106 เซลล์ / mL ที่ 37 ° C และ 5% CO2 ใน 12 well
(Corgin Costar, Corning, NY, USA) ที่มีอาหารเลี้ยงเชื้อ RPMI 1640 (GIBCO, Grand Island, NY, USA) เสริมด้วยทารกในครรภ์ 10% ของทารกในครรภ์ (HyClone Laboratories, Logan, Utah, USA)
และ 2 mol / L l-glutamine (Sigma-Aldrich) โดยไม่มี antibi-otics
พบว่า PBMC ได้รับการกระตุ้นด้วย agave fructans (สกัดจาก A. salmiana), fructans ชนิดซินโครีนอินนูลิน, L.casei, B. lactis หรือสารผสมอื่น ๆ ของ fructans / LAB ที่ความเข้มข้นที่ระบุไว้ตามการออกแบบทดลอง
2.3.2 การกระตุ้นเซลล์ต้นแบบการกระตุ้นเซลล์ต้นได้รับการวัดโดยอาศัยการวิเคราะห์ด้วยการวิเคราะห์ cytometry ของกระแสเลือดด้วย CD69 หลังจากบ่มเพาะ 24 ชั่วโมง PBMC ที่เพาะเลี้ยงได้รับการย้อมภูมิคุ้มกันด้วยแอนติบอดีต่อ monoclonal antibody ของ CD69-phycoeritrin (PE) (Becton-
Dickinson, Bioscience, San Jose, CA, USA) ล้างด้วย PBS ตรึงด้วยฟอร์มาลดีไฮด์ 1%
และวิเคราะห์โดยใช้ FACSCalibur flow cytometer ด้วยซอฟต์แวร์ Cell Quest (Becton Dickinson)
ผลการวิจัยแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ที่เป็นบวก
ใช้ PBMC ร่วมกับ phorbol myristate acetate (PMA; 20 ng / mL, Sigma-Aldrich) เป็นตัวควบคุมในเชิงบวกสำหรับเทคนิคนี้
2.3.3 การขยายตัวของเซลล์หรือวัฏจักรของเซลล์
วัฏจักรเซลล์ของเซลล์ที่ได้รับการรักษาถูกกำหนดตามเนื้อหาดีเอ็นเอของนิวเคลียร์โดยการไหลเวียนของ cytometry
หลังจากบ่ม 72 ชั่วโมง PBMC ที่เพาะปลูกจะถูกล้างด้วย PBS
และ resuspended ด้วยแรงกวนในสารละลาย fluoro-chrome hypotonic (propidium iodide ในโซเดียมซิเตรตบวก 0.1% Triton X-100)
เก็บตัวอย่างไว้ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสในที่มืดเป็นเวลา 30 นาทีก่อนการวิเคราะห์ cytometry ไหล ผลการทดลองแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ในระยะแตกต่างของวัฏจักรของเซลล์: G0 / G1 (ระยะ DNA diploid ปกติ), S (ระยะสังเคราะห์ DNA) และ G2 / M (phase mitosis)
PBMC ที่กระตุ้นด้วย phytohemagglutinin (PHA, 10 g / mL, Sigma-Aldrich) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมในเชิงบวกสำหรับเทคนิคนี้ [32]
2.3.4 ความเข้มข้นของไนไตรท์
การผลิตไนตริกออกไซด์ (NO) ในเซลล์ถูกประเมินโดยการวัดไนไตรท์ (NO2-) โดยใช้การวิเคราะห์ด้วยแผ่นไมโครแผ่นทดสอบโดยอาศัยปฏิกิริยา Griess 100 l ของ aliquots supernatant ของแต่ละ assay ถูกบ่มด้วยสารละลาย Griess A 10 ลิตร (0.1%, w / v N- (1-naphtyl) -ethylenediamine hydrochloride (NEDD)]
และ 10 ลิตรของสารละลาย Griess B (2%, w / v sulfanilamide ใน HCl 5%) ที่อุณหภูมิห้องนาน 20 นาที การดูดกลืนแสงที่ 540 นาโนเมตรได้ถูกกำหนดไว้ในเครื่องอ่าน Microplate Synergy HT Multi-Mode (Biotek, Winooski, VT, USA)
NO2- ถูกกำหนดผ่านเส้นโค้งการสอบเทียบโดยใช้โซเดียมไนไตรท์เป็นมาตรฐานที่ความเข้มข้นตั้งแต่ 0 ถึง 200 mM
PBMC กระตุ้นด้วย lipopolysaccharide (LPS; 5 g / mL E. coli;
Sigma-Aldrich) ถูกใช้เป็นตัวควบคุมในเชิงบวกสำหรับเทคนิคนี้ [33]
2.3.5 การทดลองออกแบบการทดลองเชิงทดลองแบบทางไกลเพื่อหาผลกระทบหลักของตัวแปรแบ่งตาม 2 ตัวแปร (LAB และ fructans type), 2 ตัวแปรต่อ [ความเข้มข้นของ LAB (CLAB)
และความเข้มข้นของ fructans (Cfructans)],
และปฏิสัมพันธ์ระหว่างคำสั่งซื้อครั้งแรกระหว่างพวกเขา ได้รับการคัดเลือก 6 บล็อกเพื่อลดผลกระทบที่ไม่พึงประสงค์ของความแปรปรวนของแต่ละบุคคลโดยให้ผลการทดลองทั้งหมด 30 รายการดังที่แสดงในตารางที่ 2 ตัวแปรตอบสนอง ได้แก่ การเปิดใช้งาน lymphocytes แรก (เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ CD69 บวก) การขยายตัวของเซลล์ในเซลล์ (S หรือ G2 / M) และไม่มีการผลิต
2.4 ปัจจัยการถอดรหัสแสดงออกในความแตกต่างของเม็ดเลือดขาวที่กระตุ้นด้วย PBMC
TotalRNA แยกได้จาก 2millionPBMCusing TRIzol reagent
(Invitrogen, Life Technology, Carlsbad, CA, USA),
และ concen-trations
และความสมบูรณ์ของตัวอย่างอาร์เอ็นเอได้รับการวัดโดยใช้ Spectrophotometer Synergy HT (Biotek) cDNA ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ 100n ของ RNA ทั้งหมดโดยใช้ CdNA Reverse Transcription Kit ความจุสูง (Applied Biosystems, Foster, CA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต โดยใช้การทดสอบการแสดงออกของยีน TaqMan ที่กำหนดไว้ล่วงหน้าตามคำแนะนำของผู้ผลิต (Applied Biosystems) จำนวน 100 ชุดของ cDNA ถูกนำไปใช้ PCR แบบเรียลไทม์
ใช้หัววัดต่อไปนี้: TBX21, Hs00203436 / m1; GATA3, Hs00231122 / m1; RORC, Hs01076112 / ml และ FOXP3, Hs01085834 / m1
ระดับ mRNA ถูก normalized เพื่อ 18S เป็นการควบคุม endogenous
ปฏิกิริยาทั้งหมดได้รับการวิเคราะห์โดยใช้ระบบ Real-Time PCR 7900HT CFX96 (BioRad, Hercules, CA, USA)
ค่ารอบของวัฏจักร (Ct) ซึ่งสอดคล้องกับจำนวนรอบของ PCR ที่การปล่อยการเรืองแสงได้ถึงเกณฑ์เหนือการเล็ดรอดที่เกิดขึ้นแล้วจะถูกกำหนดสำหรับการแสดงออกของ mRNA พื้นฐาน
การแสดงออก mRNA สัมพัทธ์ถูกคำนวณโดยใช้วิธีการ 2-Ct สำหรับการแสดงออกของ mRNA ที่เกี่ยวกับ mitogen ในความสัมพันธ์กับเซลล์ที่ไม่มีการกระตุ้น [34]
2.5 การวิเคราะห์ทางสถิติ
การวิเคราะห์ทางสถิติได้ดำเนินการโดยใช้ชุดสถิติของ Design Expert 7 (Stat-Ease, Minneapolis, MN, USA)
ผลลัพธ์จะถูกรายงานว่าเป็นข้อผิดพลาดมาตรฐาน± (SE) สำหรับข้อมูลพารามิเตอร์
การวิเคราะห์ความแปรปรวน (ANOVA)
และการเปรียบเทียบค่าเฉลี่ยโดยวิธี Tukey
ค่าความน่าจะเป็นของ p <0.05 ถือว่าเป็นนัยสำคัญ
3. ผลลัพธ์และการอภิปราย
3.1 การประเมินกิจกรรม prebiotic ของ fructans ลักษณะสำคัญของ prebiotics คือความสามารถในการเพิ่มการแพร่กระจายของจุลินทรีย์หรือโปรไบโอติกที่เป็นประโยชน์ใน microbiota colonic ของมนุษย์ [10] ในการศึกษาในครั้งนี้เราได้วิเคราะห์ฤทธิ์ทางชีวภาพของ A. salmiana fructans (Fructan A.s) ที่สกัดได้เมื่อเทียบกับการเตรียมสาร prebiotics แบบเดิม
ผลการทดลองแสดงให้เห็นว่าการเจริญเติบโตของ LAB (L. casei และ B. lac-tis)
และแสดงในรูปที่ 1 ผลการคำนวณถูกคำนวณเป็นความแตกต่างใน CFU / mL ระหว่างการเจริญเติบโตของสายพันธุ์
และปริมาณ inoc-ulated (CFU / mL); ดังนั้นความสูงของแถบแสดงถึงการเจริญเติบโตสุทธิหลังจาก 24 ชั่วโมงแสดงใน Log CFU / ml ตั้งแต่ 8.1 ถึง 9.3 Log CFU / mL ในการทดสอบ fructans ทั้งหมดพบว่าการเจริญเติบโตของ bacte-rial เพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติ (p <0.05) เมื่อเทียบกับการควบคุมเชิงลบ (สื่อที่มีส่วนผสมของ MRSB เชิงพาณิชย์ แต่ไม่มีแหล่งคาร์โบไฮเดรต MRSB-WCH) สำหรับ L. casei ไม่มีความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติระหว่างฟรุกโตแมนที่ผ่านการทดสอบหรือการควบคุมในทางบวก แต่การเจริญเติบโตของแบคทีเรียทั้งหมดอยู่ระหว่าง 9.07 ถึง 9.2 log CFU / mL เทียบกับมาตรฐาน MRSB เชิงพาณิชย์ซึ่งบ่งชี้ว่ามีกิจกรรม prebiotic สูง
อย่างไรก็ตามใน B. lactis ชนิดของ fructans อาจเป็นปัจจัยสำคัญ (p <0.05) เนื่องจาก agave fructans มีการเจริญเติบโตของ bacte-rial สูงสุด (8.8 ± 0.4 log CFU / mL)
และทำให้เกิดกิจกรรม prebiotic สูงสุด
พบว่าเชื้อ L. casei มีอัตราการเติบโตของแบคทีเรียสูงกว่า B.lactis (p <0.05) ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับรายงานอื่น ๆ ที่ยืนยันความแตกต่างระหว่าง L. casei และ B. lactis growth โดยใช้ saccharides [35] ความแตกต่างในความสามารถของแต่ละสายพันธุ์ในการใช้ prebiotic ที่ไม่เป็นพิษอาจสะท้อนถึงวิวัฒนาการของสายวิวัฒนาการได้กว้าง
ความแตกต่างระหว่าง L. casei
และ B. lactis เนื่องจากแบคทีเรียเหล่านี้มีอยู่
รูปที่ 1. กิจกรรม prebiotic ของ agave fructans
ผลการทำ prebiotic ของ Agave ที่สกัดได้
salmiana fructans (Fructan A.s), fructans อินติลินชนิดซิออรีน (อินนูลิน)
เชิงพาณิชย์) และตัวเร่งปฏิกิริยาชนิดอินนูลินชนิดซิลิครีน (อินนูลินปฏิกิริยา) ได้รับการประเมินโดยการเจริญเติบโตของสองสายพันธุ์ของ LAB
และเปรียบเทียบกับการควบคุมมาตรฐาน 2 ชุดคือ MRSB และ MRSB เชิงพาณิชย์ที่ไม่มีแหล่งคาร์โบไฮเดรต (MRS-WCH)
การเจริญเติบโตของแบคทีเรียแสดงเป็น Log CFU / mL ทำการตรวจวิเคราะห์ทั้งหมด
เป็นจำนวนสามเท่าและให้ผลการทดลองทั้งหมด 30 ครั้ง
ค่าคือค่าเฉลี่ย± S.E
ข้อมูลที่มีตัวอักษรตัวพิมพ์ใหญ่แตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญทางสถิติที่ระดับ p <0.05 ตามข้อมูล t-test
phyla (Firmicutes และ Actinobacteria) ตามลำดับ [18]
นอกจากนี้ยังมีปฏิสัมพันธ์ระหว่างชนิดฟรุกโตสกับความเครียด
(p <0.05) โดยที่ฟรุกโตสที่ผ่านการทดสอบทั้งหมดมีการคัดเลือกมากขึ้น
ประเภทของสายพันธุ์ที่นิยม L. casei นอกจากนี้ยังได้มีการอธิบายไว้
prebiotics ที่อาจเลือกกระตุ้นการเจริญเติบโตและกิจกรรม
จำนวนแบคทีเรียหนึ่งตัวหรือมากกว่า [10] ดังนั้น agave fructans
อาจส่งเสริมการเจริญเติบโตของ L. casei มากกว่า B. lactis
การศึกษาอื่น ๆ ในห้องปฏิบัติการได้รายงานการพึ่งพาแบคทีเรียในการปรากฏตัวของ fructo-oligosaccharides [35]
นอกจากนี้ยังมีรายงานว่า
(DP) fructans มีประสิทธิภาพมากขึ้นในการรองรับการเจริญเติบโตของ B. lactis กว่าพื้นผิว DP สูง [36]
ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า agua fructans กระตุ้นการเติบโตของ LAB แบบเดียวกัน
หรือดีกว่า fructans พาณิชย์
3.2 การกระตุ้นด้วย PBMC ในหลอดทดลองโดยใช้จุลินทรีย์สองชนิดและฟรุคโตส 2 ชนิด
เนื่องจากบทบาทของระบบภูมิคุ้มกันขั้นพื้นฐานของโปรไบโอติค
และ prebiotic เกี่ยวกับเซลล์และการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันได้รับการพิสูจน์ก่อนหน้านี้ [13,25] ในการศึกษานี้ได้รับการตรวจสอบว่า agave fructans กระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันหรือไม่
และกระตุ้นการงอกของเซลล์
ตารางที่ 3 แสดงให้เห็นถึงผลกระทบที่สำคัญของปัจจัยที่แตกต่างกันเช่น CLAB (A), CFructans (B), LAB type (C), fructans type (D)
และปฏิสัมพันธ์ระหว่างพวกเขาในการตอบสนองแต่ละ vari- สามารถ
การเปิดใช้งานของประชากรเม็ดเลือดขาวในช่วงต้นของการตอบสนองต่อสิ่งเร้า (fructans and LAB) วัดเป็นเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ CD69 บวก
การกระตุ้น Lymphocyte ขึ้นอยู่กับ CLAB (A),
fructans type (D) test ปฏิสัมพันธ์ระหว่างสายพันธุ์ LAB
และ fructans ชนิด (C × D) และความเข้มข้นของพวกเขา (A × B)
การปฏิสัมพันธ์ของ C × D จะแสดงในรูปที่ 2a สำหรับการรวม fruc-tans / LAB ที่ต่างกัน
agave fructans / L casei ผสม (F + L) พบว่ามีการกระตุ้นเพิ่มขึ้นด้วย 10.8% ของเซลล์ CD69- บวก
รูปที่ 2b แสดงการตอบสนองต่อปฏิสัมพันธ์ A × B สำหรับการผสม F + L ซึ่งการกระตุ้นด้วย CFructans สูงขึ้น
และ CLAB ต่ำกว่าโดยมี CD69 + ของ lymphocytes 12.4%
ผลลัพธ์เหล่านี้สอดคล้องกับการศึกษาก่อนหน้าที่แสดงการแสดงออก CD69 ที่เพิ่มขึ้นใน CD8 + NK
และ CD8 + T หลังจากกระตุ้นด้วยสายพันธุ์ Lactobacillus [37]
นอกจากนี้การศึกษาอื่นได้แสดงให้เห็นถึงการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของ CD4 + CD25 + (T-helper activated regulatory cells), CD8 + CD25 + (T-suppressor / cytotoxic activated cells)
และ CD16 + CD56 + (เซลล์ NK) เมื่อกระตุ้นด้วยสายพันธุ์โปรไบโอติก [38]
ข้อมูลเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าส่วนผสมของ F + L มีผลต่อระบบภูมิคุ้มกันต่อเซลล์ภูมิคุ้มกัน
อย่างไรก็ตามเราประเมินผลของ fructans ในวงจรเซลล์ PBMC
รูปที่ 3a อธิบายถึงฮิสโทแกรมดีเอ็นเอโดยทั่วไปแสดงให้เห็นประชากรของเซลล์สาม (G0 / G1, S และ G2 / M) ขึ้นอยู่กับปริมาณดีเอ็นเอ
จากขั้นตอนเหล่านี้เฉพาะช่วง S อย่างมีนัยสำคัญ (p <0.05)
ในการตอบสนองต่อ CLAB (A), LAB type (C)
และการโต้ตอบ A × B, B × C
และ B × D ในขณะที่มีชนิด
และความเข้มข้นของฟรุค - แทนเนอร์ (B และ D) ไม่มีผลต่อ
การจำลองแบบดีเอ็นเอของนิวเคลียร์เกิดขึ้นในระยะ S ซึ่งแสดงให้เห็นถึงการขยายตัวของ PBMC ซึ่งเกิดจาก LAB ในลักษณะที่ตอบสนองต่อปริมาณยา เซลล์
เปอร์เซ็นต์ในระยะ S จากการทดสอบ PBMC ที่กระตุ้นด้วย LAB
และ fructans ผสมอยู่ในรูป 3b ที่ agave fruc-tans / L casei ผสม (F + L) มีเปอร์เซ็นต์สูงสุดที่ 11.9% ซึ่งสูงกว่าที่แสดงในกลุ่มควบคุมบวก (PHA) (p> 0.05)
ในการศึกษาในร่างกายได้อธิบายการงอกที่เพิ่มขึ้น
และกิจกรรมของเซลล์ CD56 + NK ในการไหลเวียนของอุปกรณ์ต่อพ่วงหลังการบริโภค LAB ในผู้สูงอายุ [20],
และการกระตุ้นการขยายตัวของ splenocyte ของหนูในหนูหลังการสังเคราะห์ LAB [39] นอกจากนี้มีรายงานว่า Bifidobacterium longum มีประสิทธิภาพในการกระตุ้นให้เกิดการขยายตัวของ IgA + ในขนาดเล็ก
และลำไส้ใหญ่ของหนูระหว่างการติดเชื้อ [40]
ผลที่ได้จากการศึกษาในครั้งนี้แสดงให้เห็นว่า fructans / L casei ทำให้เกิดการขยายตัวของเซลล์ภูมิคุ้มกัน
นอกจากนี้เรายังได้ทำการวัดการสังเคราะห์ไนตริกออกไซด์ (NO) เพื่อยับยั้งการเจริญของ monocyte ด้วย agave fructans ความเข้มข้นของไนไตรท์ในสารละลายได้รับการพิจารณาว่าเป็นตัวชี้วัดของการสังเคราะห์ NO NO ซึ่งเป็นตัวกลางไกล่เกลี่ย
และการตอบสนองต่อการอักเสบที่ผลิตจาก mono cytes / macrophages
ตารางที่ 3 แสดงให้เห็นว่า CLAB (A)
และชนิดของ LAB (C) เป็นปัจจัยหลักที่มีผลต่อการผลิตอย่างไม่มีนัยสำคัญ
รูปที่ 4 แสดงปฏิสัมพันธ์ C × D สำหรับความเข้มข้นของไนไตรท์ที่ 24
และ 72 ชั่วโมงของ PBMC กระตุ้น
การผลิตที่ใหญ่ที่สุดคือการสังเกตที่ 72 ชั่วโมงของการบ่มในทุกกรณี,
และ agave fructans / L casei
รูปที่ 2
ผลของ agave fructans ต่อการกระตุ้นการทำงานของ lymphocytes ต้น
การแสดงออก CD69 ได้รับการประเมินใน PBMC ของผู้ที่มีสุขภาพดีโดยใช้ cytometry ไหล
PBMC แยกตามที่ระบุไว้ในส่วนที่ 2
(สารสกัดจาก Agave salmiana), fructans ชนิดอินติลินชิกโครี (reagent จาก Sigma-Aldrich), L. casei, B lactis
และสารผสมต่าง ๆ ของ fructans / LAB ที่ความเข้มข้นตามแบบการทดลอง ใช้ PBMC ที่กระตุ้นด้วย phorbol myristate acetate (PMA) จำนวน 20 ng / mL เป็นตัวควบคุมในเชิงบวก (a) ปฏิสัมพันธ์ระหว่าง C × D (p <0.05) ความเข้มข้นของ CLAB: 4 log CFU / mL
และ Cfructan 0.5 mg / mL ค่าคือค่าเฉลี่ย± LSD ของการออกแบบเชิงทดลองทางไกล
I + L: inulin และ L. casei; I + B: Inulin และ B. lactis; F + L: agave fructan บวกกับ L. casei; F + B: agave fructan พร้อมกับ B. lactis (b) การตอบสนองของปฏิสัมพันธ์ของปัจจัย A × B (p <0.05) สำหรับ L. casei
และส่วนผสม agave fructans * p <0.05 เทียบกับ PMA การควบคุมในเชิงบวก
รูปที่ 3
ผลของ agua fructans ต่อความก้าวหน้าของวงจรเซลล์
วัฏจักรเซลล์ได้รับการพิจารณาหาปริมาณดีเอ็นเอของนิวเคลียร์โดยใช้ cytometry ไหล
PBMC แยกตามที่ระบุไว้
ในส่วนที่ 2 และกระตุ้นเป็นเวลา 72 ชั่วโมงด้วย agave fructans (สกัดจาก Agave salmiana), fructans inulin ชนิดซิออน (สารจาก Sigma-Aldrich), L. casei, B. lactis
และสารผสมต่าง ๆ ของ fructans / LAB ที่ความเข้มข้นตามแบบการทดลอง ผลลัพธ์จะแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของเซลล์ในระยะต่างๆของวัฏจักรของเซลล์: G0 / G1 (ระยะ DNA ปกติ diploid), S- (ระยะสังเคราะห์ DNA),
และ G2 / M (phase mitosis)
ใช้ PBMC ที่กระตุ้นด้วย phytohemagglutinin 10 กรัม / มล. (PHA) เป็นตัวควบคุมในเชิงบวก (a) Cytometer histogram, (b) เปอร์เซ็นต์ของเซลล์ในช่วงการสังเคราะห์ปฏิกิริยาของ C × D (P <0.05) ที่ความเข้มข้นของ CLAB: 8 log CFU / mL และ Cfructans: 1 mg / mL
ค่าคือค่าเฉลี่ย± LSD ของการออกแบบเชิงทดลองทางไกล I + L: inulin และ L. casei; I + B: inulin และ B. lactis; F + L: agave fructans บวก L. casei; F + B: agave fructans พร้อมกับ B. lactis * p <0.05 เทียบกับค่าบวก PHA (F + L) พบว่าไม่มีการผลิต NO ใน monocytes สูงสุด 11.5
และ 18.3 เมกะวัตต์ NO2 เป็นเวลา 24 และ 72 ชั่วโมงตามลำดับ
ผลลัพธ์เหล่านี้มีค่ามากกว่าการควบคุมบวก (LPS) (p> 0.05) ตัวกลางไนโตรเจนปฏิกิริยาอาจมีส่วนเกี่ยวข้องกับการควบคุมการทำงานของ monocyte ซึ่งแสดงผลของ immunoregu-latory ที่เกี่ยวข้องกับการควบคุมการติดเชื้อซึ่งเป็นส่วนหนึ่งของกลไกในการเป็นสื่อกลางในการยับยั้ง cytotoxicity ของ macrophage ต่อสารก่อโรคที่แตกต่างกัน [41]
การแสดงออก CD69 เพิ่มขึ้นการเพิ่มขึ้นของเซลล์
และการผลิตไม่พบกับ probiotic L. casei และ preflotic agave fructans
ผลการศึกษานี้แสดงให้เห็นว่า agave fructans / L casei ผสมอาจมีผลต่อระบบภูมิคุ้มกันต่อลิมโฟซัยต์ T เนื่องจาก monocytes / macrophages มีบทบาทสำคัญในการควบคุมภูมิคุ้มกันโดยการนำเสนอแอนติเจนไปสู่ lymphocytes T [42,43]
สะดุดตาปฏิสัมพันธ์โดยตรงระหว่างเซลล์ระบบภูมิคุ้มกัน
และ fructans แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกสูงสุดของ CD69 ต่อ lymphocytes ของ PBMC ที่กระตุ้นอยู่เฉพาะในการปรากฏตัวของ agave fructans,
(LAB) หรือ Fructans / LAB (รูปที่ 2a)
เซลล์ที่กระตุ้นการทำงานมีปฏิสัมพันธ์กับเซลล์อื่น ๆ ที่มีองค์ประกอบภูมิคุ้มกัน
และอาจก่อให้เกิด sig-nals ภูมิคุ้มกันที่แตกต่างกันและการตอบสนอง
3.3 การแสดงออกของปัจจัยการถอดรหัสในการสร้างความแตกต่างของเม็ดเลือดขาวของ PBMC ที่ได้รับการกระตุ้นรายงานก่อนหน้านี้ระบุว่า Prebiotics / Probiotics กระตุ้นให้เกิดการเปลี่ยนประเภทของการตอบสนองภูมิคุ้มกันของ T helper ด้วย anti-gens [44,45]
ดังนั้นการแสดงออกญาติของเม็ดเลือดขาวได้รับการประเมิน
รูปที่ 5
ผลของ agua fructans ต่อการแสดงออกของปัจจัยการถอดรหัสใน lymphocytes
ระดับการแสดงออก mRNA ได้รับการประเมินใน PBMC จากคนที่มีสุขภาพดีโดยใช้ real-time PCR
PBMC แยกตามที่ระบุไว้ในส่วนที่ 2
และกระตุ้นด้วย agave fructans (สกัดจาก Agave salmiana), fructans inulin ชนิดซิออน (สารจาก Sigma-Aldrich), L. casei, B. lactis
และสารผสมต่าง ๆ ของ fructans / LAB ที่ความเข้มข้นตามแบบการทดลอง (a) สายพันธุ์ LAB, (b) fructans type, (c) สารผสมที่ความเข้มข้นของ CLAB: 8 log CFU / mL
และ Cfructans: 1 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร
นิพจน์ mRNA สัมพัทธ์ถูกคำนวณโดยใช้วิธี 2-Ct
I + L: inulin และ L. casei; I + B: inulin และ B. lactis; F + L: agave fructans บวก L. casei; F + B: agave fructans พร้อมกับ B. lactis
การทดสอบโดยไม่ซ้ำเพื่อการวิเคราะห์ทางสถิติ
fructans (อินติลินชิกอรี่และ agave fructans) แสดงการแสดงออกที่เพิ่มขึ้นของ Tbet
และปัจจัยการถอดรหัส FOXP3 (รูปที่ 5b)
ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า prebiotics กระตุ้นทางเดินอาหารของลำไส้เล็กโดยตรงหรือโดยอ้อมเพื่อให้เกิดการตอบสนองของเซลล์ T Helist ที่สมดุล
และป้องกันไม่ให้เกิดความไม่สมดุลที่ก่อให้เกิดอาการของโรคทางคลินิกได้ [47] อย่างไรก็ตามการศึกษาเพิ่มเติมเป็นสิ่งจำเป็นเพื่อแสดงให้เห็นว่า Prebiotics อาจทำให้เกิดการตอบสนองของขั้วของ T helper ได้โดยตรง
น่าสนใจปฏิสัมพันธ์ระหว่างโปรไบโอติก
และสิ่งกระตุ้นที่เป็น prebiotic (รูปที่ 5c)
ความแตกต่างที่เกิดจาก L. casei ลดลงอย่างมากโดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับ Tbet (Th1 response) เมื่อรวมกับ agave fructans เมื่อเทียบกับ L. casei คนเดียว
นอกจากนี้การแสดงออกของ B. lactis ที่แสดงออกของ GATA3 (การตอบสนอง Th2) เมื่อรวมกับ agave fructans เทียบกับ B. lactis เพียงอย่างเดียว (รูปที่ 5a และ c)
ปรากฏการณ์นี้ไม่ได้เกิดจากการผสมอินนูลิน (รูปที่ 5a และ c) เนื่องจากสารนี้ไม่ก่อให้เกิดเซลล์ Th1 หรือ Th2 โดยเฉพาะ (Tbet และ GATA3 ตามลำดับ)
ผลการทดลองเหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า agave fructans สามารถปรับเปลี่ยนเซลล์ T helper โดยเฉพาะได้ขึ้นอยู่กับชนิดของ LAB ที่ใช้
ดังนั้น agave fruc-tans ควรใช้เป็นผลิตภัณฑ์อาหารเนื่องจากสารนี้อาจกระตุ้นการตอบสนองของระบบภูมิคุ้มกันแบบปรับตัวในทิศทาง Th1 หรือ Th2
การกระตุ้นการตอบสนอง Th1 อาจป้องกันความผิดปกติของภูมิคุ้มกัน Th2 เช่นโรคภูมิแพ้ [44,45]
และการกระตุ้นการตอบสนอง Th2 เพื่อป้องกันหรือรักษาโรคภูมิคุ้มกัน Th1 เช่นโรคลำไส้อักเสบ (IBD) นอกจากนี้การเหนี่ยวนำของเซลล์ Th1 อาจเกี่ยวข้องกับการลดลงของการทำงานของเซลล์ lymphoid ที่เกี่ยวข้องกับวัย 4. ข้อสรุป
การศึกษาครั้งนี้เป็นครั้งแรกของการศึกษาผลของหลอดทดลอง agave fructans ในระบบภูมิคุ้มกัน
agave fructans มีผลต่อ prebi-otic เทียบกับฟรุกโตอินนูลินชนิดที่มีการแพร่กระจายอย่างกว้างขวางสำหรับอาหาร
และมีส่วนร่วมใน acti-vation
และความแตกต่างของเซลล์ของระบบภูมิคุ้มกันโดยการปฏิสัมพันธ์กับโปรไบโอติก
ผลลัพธ์เหล่านี้มีแนวโน้มที่จะเกิดขึ้นสำหรับ agave fructans ที่สกัดจาก A. salmiana
จำเป็นต้องมีการศึกษาในหลอดทดลองและในร่างกายเพิ่มเติมเพื่อเสริมผลเหล่านี้
และเพิ่มความเข้าใจของเราเกี่ยวกับผลกระทบโดยตรงหรือโดยอ้อมของสารเหล่านี้ต่อระบบภูมิคุ้มกันของร่างกายส่งผลให้มีการควบคุม
และการประยุกต์ใช้ fructans ในการพัฒนาผลิตภัณฑ์ที่เหมาะสม
กิตติกรรมประกาศ
งานนี้ได้รับการสนับสนุนผ่านทุนจาก CONACYT
(162350, 173965 และ 169793) และ UASLP (C12-FAI-03-58-58),
เม็กซิโก MVL ได้รับทุนการศึกษาจาก CONACYT ประเทศเม็กซิโก
อ้างอิง
[1] M. Wack, W. Blaschek, คาร์โบไฮเดรต Res 341 (2006) 1147-1153
[2] P. Kip, D. Meyer, R.H. Jellema, Int โรงรีดนม เจ 16 (2549) 1098-1103
[3] T.R. Klaenhammer, M. Kleerebezem, M. Volkmar Kopp, M. Rescigno, Nat. รายได้
Immunol 12 (2012) 728-73
No comments:
Post a Comment